बिरुवाको माइक्रोट्यूब्युललाई असर गर्ने उपन्यास बिरुवाको वृद्धि अवरोधकको रूपमा उर्सा मोनोआमाइड्सको खोज, विशेषता र कार्यात्मक सुधार।

Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजरको संस्करणमा सीमित CSS समर्थन छ।उत्कृष्ट नतिजाहरूको लागि, हामी तपाईंलाई आफ्नो ब्राउजरको नयाँ संस्करण प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)।यस बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी स्टाइल वा JavaScript बिना साइट देखाउँदै छौं।
प्राकृतिक उत्पादनहरूको खोज र लाभकारी प्रयोगले मानव जीवन सुधार गर्न मद्दत गर्न सक्छ।बिरुवाको वृद्धि निरोधक रसायनहरू झार नियन्त्रण गर्न जडीबुटीको रूपमा व्यापक रूपमा प्रयोग गरिन्छ।विभिन्न प्रकारका जडीबुटीहरू प्रयोग गर्ने आवश्यकताको कारण, कार्यको नयाँ संयन्त्रहरूसँग यौगिकहरू पहिचान गर्न आवश्यक छ।यस अध्ययनमा, हामीले Streptomyces werraensis MK493-CF1 बाट उपन्यास N -alkoxypyrrole कम्पाउन्ड, coumamonamide पत्ता लगायौं र पूर्ण संश्लेषण प्रक्रिया स्थापित गर्यौं।जैविक गतिविधि परीक्षणहरू मार्फत, हामीले पत्ता लगायौं कि urs-monoamic एसिड urs-monoamide को एक सिंथेटिक मध्यवर्ती र एक सम्भाव्यता हो।बिरुवा वृद्धि अवरोधक।थप रूपमा, हामीले विभिन्न urbenonic एसिड डेरिभेटिभहरू विकास गरेका छौं, urbenyloxy derivative (UDA) सहित, जसमा HeLa कोषहरूको वृद्धिलाई नकारात्मक असर नगरी उच्च जडिबुटी गतिविधि हुन्छ।हामीले यो पनि फेला पार्‍यौं कि urmotonic एसिड डेरिभेटिभहरूले बिरुवाको माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई बाधा पुर्‍याउँछ;थप रूपमा, KAND ले एक्टिन फिलामेन्टहरूलाई असर गर्छ र कोशिकाको मृत्युलाई प्रेरित गर्छ;यी बहुमुखी प्रभावहरू ज्ञात माइक्रोट्यूब्युल अवरोधकहरू भन्दा भिन्न छन् र ursonic एसिडको लागि कार्यको नयाँ संयन्त्रको सुझाव दिन्छ, जसले नयाँ जडीबुटीको विकासमा महत्त्वपूर्ण फाइदा प्रतिनिधित्व गर्दछ।
लाभदायक प्राकृतिक उत्पादनहरू र तिनीहरूका व्युत्पन्नहरूको खोज र व्यावहारिक प्रयोग मानव जीवनको गुणस्तर सुधार गर्ने माध्यम हो।सूक्ष्मजीव, बोटबिरुवा र कीराहरू द्वारा उत्पादित माध्यमिक मेटाबोलाइटहरूले औषधि र कृषिमा ठूलो प्रगति गरेको छ।धेरै एन्टिबायोटिक र एन्टी-ल्यूकेमिया औषधिहरू प्राकृतिक उत्पादनहरूबाट विकसित भएका छन्।साथै, विभिन्न प्रकारकाकीटनाशकहरू, कृषिमा प्रयोगको लागि यी प्राकृतिक उत्पादनहरूबाट फङ्गिसाइड र जडीबुटीहरू निकालिन्छन्।विशेष गरी, झार नियन्त्रण जडीबुटीहरू आधुनिक कृषिमा बाली उत्पादन बढाउन महत्त्वपूर्ण औजार हुन्, र विभिन्न प्रकारका यौगिकहरू पहिले नै व्यावसायिक रूपमा प्रयोग भइरहेका छन्।बिरुवाहरूमा धेरै सेलुलर प्रक्रियाहरू, जस्तै प्रकाश संश्लेषण, एमिनो एसिड चयापचय, कोशिका पर्खाल संश्लेषण, माइटोसिसको नियमन, फाइटोहर्मोन सिग्नलिंग, वा प्रोटीन संश्लेषण, जडीबुटीहरूको विशिष्ट लक्ष्य मानिन्छ।माइक्रोट्युब्युल प्रकार्यलाई अवरोध गर्ने यौगिकहरू जडीबुटीहरूको एक सामान्य वर्ग हुन् जसले माइटोटिक नियमन २ लाई असर गरेर बोटको वृद्धिलाई असर गर्छ।
माइक्रोट्युब्युलहरू साइटोस्केलेटनका घटक हुन् र युकेरियोटिक कोशिकाहरूमा व्यापक रूपमा संरक्षित हुन्छन्।Tubulin heterodimer मा α-tubulin र β-tubulin लेनियर माइक्रोट्युब्युल प्रोटोफिलामेन्टहरू हुन्छन्, जसमा 13 प्रोटोफिलामेन्टहरू बेलनाकार संरचना बनाउँछन्।माइक्रोट्युब्युलहरूले बिरुवाको कोशिकाहरूमा धेरै भूमिका खेल्छन्, जसमा कोशिकाको आकार, कोशिका विभाजन, र इन्ट्रासेलुलर ट्रान्सपोर्ट3,4 निर्धारण गर्ने समावेश छ।बिरुवाको कोशिकाहरूले इन्टरफेस प्लाज्मा झिल्ली मुनि माइक्रोट्यूब्युलहरू समावेश गर्दछ, र यी तथाकथित कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरूले सेल्युलोज सिन्थेज कम्प्लेक्सको नियमन मार्फत सेलुलोज माइक्रोफिब्रिलहरूको संगठनलाई नियन्त्रण गर्ने सोचाइन्छ।रूट एपिडर्मल कोशिकाहरूको कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरू, जरा टिपको द्रुत लम्बाइको क्षेत्रमा अवस्थित छन्, पार्श्वमा अवस्थित छन्, र सेल्युलोज माइक्रोफाइबरहरूले यी माइक्रोट्यूब्युलहरू पछ्याउँछन् र सेल विस्तारको दिशालाई सीमित गर्दछ, जसले एनिसोट्रोपिक सेल लम्बाइलाई बढावा दिन्छ।तसर्थ, माइक्रोट्यूब्युल प्रकार्य बिरुवा आकार विज्ञान संग नजिकको सम्बन्ध छ।जीन एन्कोडिङ ट्युब्युलिनमा एमिनो एसिड प्रतिस्थापनले एराबिडोप्सिस 6,7 मा कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युल एरे र बायाँ- वा दायाँ-पक्षीय वृद्धिको स्क्यु निम्त्याउँछ।त्यसैगरी, माइक्रोट्यूब्युल-सम्बन्धित प्रोटीनहरूमा उत्परिवर्तन जसले माइक्रोट्यूब्युल गतिशीलतालाई विनियमित गर्दछ पनि विकृत जराको वृद्धि 8,9,10,11,12,13 निम्त्याउन सक्छ।थप रूपमा, माइक्रोट्युब्युल-अवरोध गर्ने जडीबुटीहरू जस्तै डिसोपायरामाइड, जसलाई प्रिटिलाक्लोर पनि भनिन्छ, प्रयोग गर्दा पनि बायाँ-पक्षीय तिरछा जराको वृद्धि हुन्छ।यी तथ्याङ्कहरूले संकेत गर्दछ कि माइक्रोट्यूब्युल प्रकार्यको सटीक नियमन बोटको वृद्धिको दिशा निर्धारण गर्न महत्त्वपूर्ण छ।
विभिन्न प्रकारका माइक्रोट्यूब्युल इन्हिबिटरहरू पत्ता लगाइएका छन्, र यी औषधिहरूले साइटोस्केलेटल अनुसन्धान, साथै कृषि र औषधिमा महत्त्वपूर्ण योगदान पुर्‍याएका छन्।विशेष गरी, oryzalin, dinitroaniline यौगिकहरू, disopyramide, benzamide-सम्बन्धित यौगिकहरू, र तिनीहरूका एनालगहरूले माइक्रोट्यूब्युल कार्यलाई रोक्छ र यसरी बोटको वृद्धिलाई रोक्छ।त्यसैले, तिनीहरू व्यापक रूपमा जडीबुटीको रूपमा प्रयोग गरिन्छ।यद्यपि, माइक्रोट्युब्युलहरू बोटबिरुवा र जनावर कोषहरूको एक महत्त्वपूर्ण घटक हुनाले, धेरैजसो माइक्रोट्यूब्युल अवरोधकहरू दुवै प्रकारका कोशिकाहरूमा साइटोटोक्सिक हुन्छन्।तसर्थ, जडीबुटीको रूपमा तिनीहरूको मान्यता प्राप्त उपयोगिताको बावजूद, सीमित संख्यामा एन्टिमाइक्रोट्युब्युल एजेन्टहरू व्यावहारिक उद्देश्यका लागि प्रयोग गरिन्छ।
Streptomyces परिवार Streptomyces को एक जीनस हो, जसमा एरोबिक, ग्राम-पॉजिटिभ, फिलामेन्टस ब्याक्टेरिया समावेश छ र माध्यमिक चयापचय को एक विस्तृत श्रृंखला को उत्पादन गर्ने क्षमता को लागी व्यापक रूपमा परिचित छ।तसर्थ, यो नयाँ जैविक रूपमा सक्रिय प्राकृतिक उत्पादनहरूको सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण स्रोतहरू मध्ये एक मानिन्छ।हालको अध्ययनमा, हामीले क्युमामोनामाइड भनिने नयाँ यौगिक पत्ता लगायौं, जुन Streptomyces werraensis MK493-CF1 र S. werraensis ISP 5486 बाट अलग गरिएको थियो। स्पेक्ट्रल विश्लेषण र पूर्ण वर्णक्रमीय विश्लेषण प्रयोग गरेर, coumamonamide को संरचना विशेषता थियो र यसको अद्वितीय N-N-N-N-N-SQL-SQL-ANK- निर्धारण गरिएको थियो।संश्लेषण।Ursmonic acid, ursmonoamide र यसको डेरिभेटिभहरूको एक सिंथेटिक मध्यवर्ती, लोकप्रिय मोडेल बिरुवा Arabidopsis thaliana को वृद्धि र अंकुरण रोक्न पाइयो।संरचना-गतिविधि सम्बन्ध अध्ययनमा, हामीले फेला पार्यौं कि C9 को साथ एक कम्पाउन्डले ursonic एसिडमा परिमार्जन गर्‍यो, जसलाई ursonic acid को nonyloxy derivative (KAND) भनिन्छ, यसले वृद्धि र अंकुरणमा अवरोध गर्ने प्रभावलाई उल्लेखनीय रूपमा बढाउँछ।उल्लेखनीय रूपमा, नयाँ पत्ता लागेको बिरुवाको वृद्धि अवरोधकले तंबाकू र लिभरवर्टको वृद्धिलाई पनि असर गर्यो र ब्याक्टेरिया वा हेला कोशिकाहरूमा साइटोटोक्सिक थिएन।यसबाहेक, केही urmotonic एसिड डेरिभेटिभहरूले एक विकृत रूट फेनोटाइपलाई प्रेरित गर्दछ, जसले यी डेरिभेटिभहरूले प्रत्यक्ष वा अप्रत्यक्ष रूपमा माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई असर गर्छ।यस विचारसँग अनुरूप, इम्युनोहिस्टोकेमिकली वा फ्लोरोसेन्ट प्रोटीनको साथ लेबल गरिएको माइक्रोट्यूब्युलहरूको हाम्रो अवलोकनले केएनडी उपचारले माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई डिपोलिमराइज गर्दछ भनेर संकेत गर्दछ।थप रूपमा, कुमामोटोनिक एसिड डेरिभेटिभहरूसँगको उपचारले एक्टिन माइक्रोफिलामेन्टहरू बाधा पुर्‍यायो।यसरी, हामीले एउटा नयाँ बिरुवा वृद्धि अवरोधक पत्ता लगाएका छौं जसको कार्यको अद्वितीय संयन्त्रले साइटोस्केलेटनको विनाश समावेश गर्दछ।
स्ट्रेन MK493-CF1 टोकियोको शिनागावा-कुमा माटोबाट अलग गरिएको थियो।स्ट्रेन MK493-CF1 राम्रो-शाखा भएको स्ट्रोमल माइसेलियम गठन भयो।16S ribosomal RNA जीन (1422 bp) को आंशिक अनुक्रम निर्धारण गरिएको थियो।यो तनाव S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: विशिष्ट तनाव, 99.93%) सँग धेरै मिल्दोजुल्दो छ।यस नतिजाको आधारमा, यो निर्धारण गरिएको थियो कि यो तनाव S. werraensis को प्रकार तनावसँग नजिकको सम्बन्ध थियो।त्यसैले, हामीले अस्थायी रूपमा यस स्ट्रेनलाई S. werraensis MK493-CF1 नाम दियौं।S. werraensis ISP 5486T ले पनि उही बायोएक्टिभ यौगिकहरू उत्पादन गर्दछ।यस सूक्ष्मजीवबाट प्राकृतिक उत्पादनहरू प्राप्त गर्न प्रारम्भिक अनुसन्धान नभएकोले, थप रासायनिक अनुसन्धानहरू गरियो।S. werraensis MK493-CF1 को जौको माध्यममा 30 डिग्री सेल्सियसमा 14 दिनको लागि ठोस अवस्था किण्वनद्वारा खेती गरिसकेपछि, 50% EtOH संग माध्यम निकालियो।५९.५ मिलीग्राम कच्चा निकासी प्राप्त गर्न ६० एमएल नमूना सुकाइएको थियो।कच्चा निकासी N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, नाम coumamonamide, 36.0 mg) दिन रिभर्स चरण HPLC को अधीनमा थियो।1 को कुल रकम कच्चा निकासी को लगभग 60% हो।त्यसकारण, हामीले कुमामोटोमाइड १ को गुणहरू विस्तारमा अध्ययन गर्ने निर्णय गर्यौं।
Coumamonamide 1 एक सेतो अमोर्फस पाउडर हो र उच्च रिजोलुसन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HRESIMS) C6H8N2O2 (चित्र 1) को पुष्टि गर्दछ।यस कम्पाउन्डको C2- प्रतिस्थापित पाइरोल टुक्रालाई δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR स्पेक्ट्रममा: 4.5 Hz) द्वारा विशेषता गरिएको छ। , H-5) र δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), र 13C NMR स्पेक्ट्रमले चार sp2 कार्बन परमाणुहरूको उपस्थिति देखाउँछ।C2 स्थितिमा एमाइड समूहको उपस्थिति δC 161.1 मा C-3 प्रोटोनबाट एमाइड कार्बोनिल कार्बनमा HMBC सहसंबंधद्वारा मूल्याङ्कन गरिएको थियो।थप रूपमा, δH 4.10 (3H, S) र δC 68.3 मा 1 H र 13 C NMR शिखरहरूले अणुमा N-methoxy समूहहरूको उपस्थितिलाई संकेत गर्दछ।यद्यपि मेथोक्सी समूहको सही स्थिति अझैसम्म स्पेक्ट्रोस्कोपिक विश्लेषण प्रयोग गरी निर्धारण गरिएको थिएन जस्तै परिष्कृत भिन्नता स्पेक्ट्रोस्कोपी र परमाणु ओभरहाउजर संक्षिप्त नाम (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide पहिलो उम्मेद्वार यौगिक बन्यो।
1 को सही संरचना निर्धारण गर्न, कुल संश्लेषण प्रदर्शन गरिएको थियो (चित्र 2a)।m-CPBA संग व्यावसायिक रूपमा उपलब्ध 2-aminopyridine 2 को उपचारले परिमाणात्मक उपजमा सम्बन्धित N-oxide 3 को परिणाम दिन्छ।2 को 2-एमिनोअजिडेसन पछि, अब्रामोविचले वर्णन गरेको साइक्लोकन्डेन्सेसन प्रतिक्रियालाई बेन्जिनमा 90 डिग्री सेल्सियसमा ग्राममा चाहिएको 1-हाइड्रोक्सी-1एच-पाइरोल-2-कार्बोनिट्रिल 5 प्राप्त गर्न गरिएको थियो।गति 60% (दुई चरणहरू)।१५,१६।4 को मिथाइलेशन र हाइड्रोलाइसिसले त्यसपछि 1-मेथोक्सी-1एच-पाइरोल-2-कार्बोक्सिलिक एसिड ("क्युमोटोनिक एसिड" भनिन्छ, 6) राम्रो उपज (70%, दुई चरण) मा दियो।अन्तमा, एसिड क्लोराइड मध्यवर्ती 6 मार्फत जलीय अमोनिया प्रयोग गरेर एमिडेशनले कुमामोटो एमाइड 1 मा 98% उत्पादन दियो।संश्लेषित 1 को सबै वर्णक्रमीय डेटा पृथक 1 जस्तै थियो, त्यसैले 1 को संरचना निर्धारण गरिएको थियो;
सामान्य संश्लेषण र urbenamide र urbenic एसिड को जैविक गतिविधि को विश्लेषण।(a) कुमामोटो एमाइडको कुल संश्लेषण।(b) सात दिन पुरानो जंगली-प्रकार Arabidopsis Columbia (Col) बिरुवाहरू मुरासिगे र Skoog (MS) प्लेटहरूमा कुमामोनामाइड 6 वा coumamonamide 1 संकेतित सांद्रतामा हुर्काइयो।स्केल बार = 1 सेमी।
पहिले, हामीले बिरुवाको वृद्धि परिमार्जन गर्ने क्षमताको लागि अर्बेनामाइड र यसको मध्यवर्तीहरूको जैविक गतिविधिहरूको मूल्याङ्कन गर्यौं।हामीले MS agar माध्यममा ursmonamide 1 वा ursmonic acid 6 को विभिन्न सांद्रताहरू थप्यौं र यस माध्यममा कल्चर गरिएको Arabidopsis thaliana बिरुवाहरू थप्यौं।यी परीक्षणहरूले देखाए कि 6 को उच्च सांद्रता (500 μM) ले जराको वृद्धिलाई रोक्छ (चित्र 2b)।अर्को, हामीले 6 को N1 स्थिति प्रतिस्थापन गरेर विभिन्न डेरिभेटिभहरू उत्पन्न गर्यौं र तिनीहरूमा संरचना-गतिविधि सम्बन्ध अध्ययनहरू प्रदर्शन गर्‍यौं (एनालॉग संश्लेषण प्रक्रियालाई समर्थन जानकारी (SI) मा वर्णन गरिएको छ)।Arabidopsis बिरुवाहरू 50 μM ursonic एसिड डेरिभेटिभहरू भएको माध्यममा हुर्काइयो, र जराको लम्बाइ मापन गरियो।जसरी चित्रमा देखाइएको छ।चित्र 3a, b, र S1 मा देखाइए अनुसार, कउमामो एसिडहरूसँग N1 स्थितिमा विभिन्न लम्बाइ रैखिक अल्कोक्सी चेनहरू (9, 10, 11, 12, र 13) वा ठूलो अल्कोक्सी चेनहरू (15, 16, र 17) हुन्छन्।डेरिभेटिभहरूले जराको वृद्धिमा महत्त्वपूर्ण अवरोध देखायो।थप रूपमा, हामीले 200 μM 10, 11, वा 17 अवरोध अंकुरण (Figs. 3c र S2) को प्रयोग भेट्टायौं।
कुमामोटो एमाइड र सम्बन्धित यौगिकहरूको संरचना-गतिविधि सम्बन्धको अध्ययन।(a) एनालॉगहरूको संरचना र संश्लेषण योजना।(b) 50 μM क्युमामोनामाइड डेरिभेटिभहरू सहित वा बिना एमएस माध्यममा हुर्किएको 7-दिन पुरानो बिरुवाहरूको जराको लम्बाइको मात्रा।तारा चिन्हहरूले शैम उपचारको साथ महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (t परीक्षण, p<०.०५)।n>18. डेटा औसत ± SD को रूपमा देखाइन्छ।nt को अर्थ "परीक्षण नगरिएको" हो किनभने बीउको ५०% भन्दा बढी अंकुरण भएन।(c) 200 μM क्युमामोनामाइड र सम्बन्धित यौगिकहरू सहित वा बिना एमएस माध्यममा 7 दिनसम्म प्रशोधित बीउहरूको अंकुरण दरको मात्रा।तारा चिन्हहरूले शैम उपचार (ची-वर्ग परीक्षण) सँग महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ।n = 96।
चाखलाग्दो कुरा के छ भने, C9 भन्दा लामो अल्काइल साइड चेनहरू थप्दा निरोधात्मक गतिविधि कम भयो, यसले सुझाव दिन्छ कि कुमामोटोइक एसिड-सम्बन्धित यौगिकहरूलाई तिनीहरूको जैविक गतिविधि प्रदर्शन गर्न निश्चित साइजको साइड चेनहरू चाहिन्छ।
किनकी संरचना-गतिविधि सम्बन्ध विश्लेषणले देखाएको छ कि C9 लाई ursonic एसिडमा परिमार्जन गरिएको थियो र ursonic acid को nonyloxy व्युत्पन्न (यसपछि KAND 11 भनिन्छ) सबैभन्दा प्रभावकारी बिरुवा वृद्धि अवरोधक थियो, हामीले KAND 11 को थप विस्तृत विशेषता सञ्चालन गर्यौं। Arabidopsis को उपचार। ५० μM KAND 11 ले लगभग पूर्ण रूपमा अंकुरणलाई रोक्यो, जबकि KAND 11 को कम सांद्रता (40, 30, 20, वा 10 μM) ले खुराक-निर्भर तरिकामा जराको वृद्धिलाई रोक्यो (चित्र 4a, b)।KAND 11 ले जरा मेरिस्टेम व्यवहार्यतालाई असर गर्छ कि गर्दैन भनेर परीक्षण गर्न, हामीले प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) र मापन गरिएको मेरिस्टेम क्षेत्रको आकारले दागिएको जरा मेरिस्टेमहरू जाँच्यौं।25 μM KAND-11 भएको माध्यममा हुर्किएको बिरुवाको मेरिस्टेमको आकार 151.1 ± 32.5 μm थियो, जबकि DMSO भएको नियन्त्रण माध्यममा हुर्किएको बिरुवाको मेरिस्टेमको आकार 264.7 ± 30.8 μm (Figdm), 4.7 μm थियो। , जसले संकेत गर्दछ कि KAND-11 ले सेलुलर गतिविधि पुनर्स्थापित गर्दछ।फैलाउने।जरा मेरिस्टेम।यससँग अनुरूप, KAND 11 उपचारले सेल डिभिजन मार्कर CDKB2; 1p:: CDKB2; 1-GUS संकेत रूट मेरिस्टेममा कम गर्यो (चित्र 4e) 17।यी नतिजाहरूले संकेत गर्दछ कि KAND 11 ले सेल प्रसार गतिविधि घटाएर जराको वृद्धिलाई रोक्छ।
विकास मा urbenonic एसिड डेरिवेटिव्स (urbenyloxy डेरिवेटिभ्स) को अवरोध प्रभाव को विश्लेषण।(a) 7-दिन पुरानो जंगली-प्रकार कोल बिरुवाहरू MS प्लेटहरूमा KAND 11 को सङ्केत गरिएको सांद्रतामा हुर्काइएको। स्केल बार = 1 सेमी।(b) जराको लम्बाइको परिमाण।अक्षरहरूले महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (Tukey HSD परीक्षण, p<०.०५)।n>16. डेटा औसत ± SD को रूपमा देखाइएको छ।(c) 25 μM KAND 11 सँग वा बिना एमएस प्लेटहरूमा हुर्किएको प्रोपिडियम आयोडाइड-स्टेन्ड जंगली-प्रकारको कोल जराहरूको कन्फोकल माइक्रोस्कोपी। सेतो कोष्ठकले जरा मेरिस्टेमलाई संकेत गर्छ।स्केल बार = 100 µm।(d) जरा मेरिस्टेम साइजको मात्रा (n = 10 देखि 11)।सांख्यिकीय भिन्नताहरू t-test (p<०.०५)।बारहरूले औसत मेरिस्टेम आकारलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।(e) CDKB2 निर्माण भएको रूट मेरिस्टेमको विभेदक हस्तक्षेप कन्ट्रास्ट (DIC) माइक्रोस्कोपी;1pro: CDKB2;1-GUS 5-दिन पुरानो बिरुवामा 25 µM KAND परखको साथ वा बिना MS प्लेटहरूमा उब्जाइएको दाग र दाग।
KAND 11 को फाइटोटोक्सिसिटी अर्को dicotyledonous बिरुवा, सुर्ती (निकोटियाना tabacum), र एक प्रमुख भूमि बिरुवा मोडेल जीव, लिभरवर्ट (Marchantia polymorpha) प्रयोग गरेर थप परीक्षण गरिएको थियो।Arabidopsis को मामलामा जस्तै, तंबाकू SR-1 बिरुवाले 25 μM KAND 11 भएको मध्यममा उब्जाएको बिरुवाले छोटो जरा उत्पादन गर्छ (चित्र 5a)।थप रूपमा, 48 बीउहरू मध्ये 200 μM KAND 11 भएको प्लेटहरूमा अंकुरण भयो, जबकि सबै 48 बीउहरू नक्कली-उपचार गरिएको मिडियामा अंकुरित भए, जसले KAND को उच्च सांद्रता महत्त्वपूर्ण थियो भनेर संकेत गर्दछ।<०.०५;chi test-square) तंबाकूको अंकुरणलाई रोक्छ।(चित्र 5b)।थप रूपमा, लिभरवर्टमा ब्याक्टेरियाको वृद्धिलाई रोक्ने KAND 11 को एकाग्रता Arabidopsis (Fig. 5c) मा प्रभावकारी एकाग्रता जस्तै थियो।यी परिणामहरूले संकेत गर्दछ कि KAND 11 ले विभिन्न प्रकारका बिरुवाहरूको वृद्धिलाई रोक्न सक्छ।हामीले त्यसपछि अन्य जीवहरूमा भालु मोनोअमाइड-सम्बन्धित यौगिकहरूको सम्भावित साइटोटोक्सिसिटीको अनुसन्धान गर्‍यौं, क्रमशः उच्च जनावर र ब्याक्टेरिया कोशिकाहरूको प्रतिनिधिको रूपमा मानव हेला कोशिकाहरू र एस्चेरिचिया कोलाई स्ट्रेन DH5α।कोशिका प्रवर्द्धन परीक्षणहरूको एक श्रृंखलामा, हामीले देख्यौं कि क्युमामोनामाइड 1, क्युमामोनामिडिक एसिड 6, र KAND 11 ले 100 μM (चित्र 5d, e) को सांद्रतामा HeLa वा E. कोलाई कोषहरूको वृद्धिलाई असर गर्दैन।
गैर-अरबीडोप्सिस जीवहरूमा KAND 11 को वृद्धि अवरोध।(a) दुई हप्ता पुरानो जंगली-प्रकार SR-1 सुर्तीका बिरुवाहरू 25 μM KAND 11 भएको ठाडो रूपमा राखिएको एमएस प्लेटहरूमा हुर्काइयो। (b) दुई हप्ता पुरानो जंगली-प्रकार SR-1 सुर्तीका बिरुवाहरू तेर्सो स्थितिमा हुर्काइयो। 200 μM KAND 11 समावेश भएको MS प्लेटहरू। (c) दुई हप्ता पुरानो जंगली-प्रकार Tak-1 लिभरवर्ट कलिलाहरू गाम्बोर्ग B5 प्लेटहरूमा KAND 11 को सङ्केत गरिएको सांद्रतामा हुर्कियो। रातो तीरहरूले दुई-हप्ताको इन्क्युबेशन भित्र बढ्दै गएका बीजाणुहरू संकेत गर्छन्। अवधि।(d) HeLa कोशिकाहरूको सेल प्रसार परख।व्यवहार्य कक्षहरूको संख्या सेल गणना किट 8 (डोजिन्डो) प्रयोग गरेर निश्चित समय अन्तरालहरूमा मापन गरिएको थियो।नियन्त्रणको रूपमा, HeLa कोशिकाहरूलाई 5 μg/ml actinomycin D (Act D) द्वारा उपचार गरियो, जसले RNA पोलिमरेज ट्रान्सक्रिप्शनलाई रोक्छ र कोशिकाको मृत्यु निम्त्याउँछ।विश्लेषणहरू ट्रिपलिकेटमा प्रदर्शन गरिएको थियो।(e) ई. कोलाई सेल प्रसार परख।ई. कोलाई वृद्धि OD600 मापन गरेर विश्लेषण गरिएको थियो।नियन्त्रणको रूपमा, कोशिकाहरूलाई 50 μg/ml एम्पिसिलिन (Amp) द्वारा उपचार गरियो, जसले ब्याक्टेरियाको सेल पर्खाल संश्लेषणलाई रोक्छ।विश्लेषणहरू ट्रिपलिकेटमा प्रदर्शन गरिएको थियो।
युरामाइड-सम्बन्धित यौगिकहरूले गर्दा साइटोटोक्सिसिटीको कार्यको संयन्त्रलाई बुझ्नको लागि, हामीले मध्यम निरोधात्मक प्रभावहरूको साथ अर्बेनिक एसिड डेरिभेटिभहरू पुन: विश्लेषण गर्यौं।जसरी चित्रमा देखाइएको छ।चित्र 2b, 6a मा देखाइए अनुसार, urmotonic एसिड 6 को उच्च सांद्रता (200 μM) युक्त आगर प्लेटहरूमा हुर्केका बिरुवाहरूले छोटो र बायाँ घुमाउरो जराहरू (θ = – 23.7 ± 6.1) उत्पादन गरे, जबकि नियन्त्रण माध्यममा हुर्किएका बिरुवाहरू। बिरुवाले लगभग सीधा जरा (θ = - 3.8 ± 7.1) उत्पादन गर्यो।यो विशेषता तिरछा वृद्धि cortical microtubules 14,18 को डिसफंक्शन को परिणाम को रूप मा जानिन्छ।यस खोजसँग अनुरूप, माइक्रोट्युब्युल-अस्थिर औषधि डिसोपायरामाइड र ओरिजालिनले हाम्रो वृद्धि अवस्थाहरूमा समान जरा झुकाव प्रेरित गर्‍यो (चित्र 2b, 6a)।एकै समयमा, हामीले urmotonic एसिड डेरिभेटिभहरू परीक्षण गर्‍यौं र तिनीहरूमध्ये धेरै चयन गर्‍यौं जसले, निश्चित सांद्रतामा, तिरछा जराको वृद्धिलाई प्रेरित गर्‍यो।यौगिकहरू 8, 9, र 15 ले क्रमशः 75 μM, 50 μM, र 40 μM मा जरा वृद्धिको दिशा परिवर्तन गर्यो, यी यौगिकहरूले प्रभावकारी रूपमा माइक्रोट्यूब्युलहरू (चित्र 2b, 6a) लाई अस्थिर बनाउन सक्छन् भनेर संकेत गर्दछ।हामीले सबैभन्दा शक्तिशाली ursolic एसिड डेरिभेटिभ, KAND 11, कम एकाग्रता (15 µM) मा पनि परीक्षण गर्‍यौं र पत्ता लगायौं कि KAND 11 को प्रयोगले जराको वृद्धिलाई रोक्छ र जराको विकासको दिशा असमान थियो, यद्यपि तिनीहरू बायाँ तिर ढलान थिए ( चित्र C3)।।किनकी माइक्रोट्युब्युल-अस्थिर औषधिको उच्च सांद्रताले कहिलेकाहीँ जरा झुकाउनको सट्टा बिरुवाको बृद्धिलाई रोक्छ, हामीले पछि KAND 11 ले जरा एपिडर्मल कोशिकाहरूमा कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरू हेरेर माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई असर गर्ने सम्भावनाको मूल्याङ्कन गर्‍यौं।25 μM KAND 11 सँग उपचार गरिएको बिरुवाको जराको एपिडर्मल कोशिकाहरूमा एन्टि-बीटा-ट्यूब्युलिन एन्टिबडीहरू प्रयोग गरेर इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्रीले लम्बाइ क्षेत्र (चित्र 6b) मा एपिडर्मल कोशिकाहरूमा लगभग सबै कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरू हराएको देखाएको छ।यी नतिजाहरूले संकेत गर्दछ कि कुमामोटोनिक एसिड र यसको डेरिभेटिभहरूले माइक्रोट्यूब्युलहरूमा प्रत्यक्ष वा अप्रत्यक्ष रूपमा कार्य गर्दछ तिनीहरूलाई बाधा पुर्‍याउन र यी यौगिकहरू उपन्यास माइक्रोट्यूब्युल अवरोधकहरू हुन्।
Ursonic एसिड र यसको डेरिभेटिभहरूले Arabidopsis thaliana मा cortical microtubules परिवर्तन गर्दछ।(a) संकेतित सांद्रताहरूमा विभिन्न urmotonic एसिड डेरिभेटिभहरूको उपस्थितिमा मापन गरिएको मूल झुकाव कोण।माइक्रोट्यूब्युलहरू रोक्न ज्ञात दुई यौगिकहरूको प्रभावहरू: डिसोपायरामाइड र ओरिजालिन पनि विश्लेषण गरियो।इनसेटले मूल वृद्धि कोण मापन गर्न प्रयोग गरिएको मानक देखाउँछ।तारा चिन्हहरूले शैम उपचारको साथ महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (t परीक्षण, p<०.०५)।n>19. स्केल बार = 1 सेमी।(b) लम्बाइ क्षेत्रको एपिडर्मल कोशिकाहरूमा कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरू।25 μM KAND 11 सँग वा बिना MS प्लेटहरूमा हुर्किएका जंगली-प्रकार Arabidopsis Col जराहरूमा माइक्रोट्यूब्युलहरू β-tubulin प्राथमिक एन्टिबडीहरू र Alexa Fluor-conjugated माध्यमिक एन्टिबडीहरू प्रयोग गरेर इम्युनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिङद्वारा कल्पना गरिएको थियो।स्केल बार = 10 µm।(c) जरा मेरिस्टेममा माइक्रोट्यूब्युलहरूको माइटोटिक संरचना।माइक्रोट्युब्युलहरू इम्युनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग प्रयोग गरेर कल्पना गरिएको थियो।माइटोटिक संरचनाहरू, प्रोफेस जोनहरू, स्पिन्डलहरू, र फ्र्याग्मोप्लास्टहरू सहित, कन्फोकल छविहरूबाट गणना गरियो।तीरहरूले माइटोटिक माइक्रोट्यूब्युल संरचनाहरू संकेत गर्दछ।तारा चिन्हहरूले शैम उपचारको साथ महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (t परीक्षण, p<०.०५)।n>9. स्केल बार = 50 µm।
यद्यपि उर्सासँग माइक्रोट्यूब्युल प्रकार्यलाई बाधा पुर्‍याउने क्षमता छ, यसको कार्यको संयन्त्र सामान्य माइक्रोट्यूब्युल डिपोलिमराइजिंग एजेन्टहरू भन्दा फरक हुने अपेक्षा गरिएको छ।उदाहरणका लागि, डिसोपायरामाइड र ओरिजालिन जस्ता माइक्रोट्यूब्युल डिपोलिमराइजिङ एजेन्टहरूको उच्च सांद्रताले एपिडर्मल कोशिकाहरूको एनिसोट्रोपिक विस्तारलाई प्रेरित गर्छ, जबकि KAND 11 ले गर्दैन।थप रूपमा, KAND 11 र disopyramide को सह-अनुप्रयोगको परिणामस्वरूप संयुक्त disopyramide-प्रेरित जरा वृद्धि प्रतिक्रिया र KAND 11-प्रेरित वृद्धि अवरोध अवलोकन गरियो (चित्र S4)।हामीले KAND 11 लाई हाइपरसेन्सिटिभ डिसोपायरामाइड 1-1 (phs1-1) उत्परिवर्ती प्रतिक्रियाको पनि विश्लेषण गर्‍यौं। phs1-1 सँग गैर-क्यानोनिकल ट्युब्युलिन किनेज बिन्दु उत्परिवर्तन छ र डिसोपाइरामाइड 9,20 सँग उपचार गर्दा छोटो जराहरू उत्पादन गर्दछ।phs1-1 उत्परिवर्ती बिरुवाहरू Agar माध्यममा हुर्केका KAND 11 को डिसोपिरामिड (fig. S5) मा उब्जाइएको जस्तै छोटो जराहरू थिए।
थप रूपमा, हामीले KAND 11 सँग उपचार गरिएको बिरुवाको जरा मेरिस्टेममा प्रोफेस जोन, स्पिन्डल र फ्र्याग्मोप्लास्ट जस्ता माइटोटिक माइक्रोट्यूब्युल संरचनाहरू अवलोकन गर्यौं। माइटोटिक माइक्रोट्यूब्युलहरूको संख्या अवलोकन गरियो (चित्र। 6c)।
सबसेलुलर रिजोल्युसनमा KAND 11 को साइटोटोक्सिसिटी विशेषता गर्न, हामीले KAND 11 सँग तंबाकू BY-2 निलम्बन कक्षहरूको उपचार गर्यौं र तिनीहरूको प्रतिक्रिया अवलोकन गर्यौं।हामीले पहिलो पटक KAND 11 को BY-2 कक्षहरूमा TagRFP-TUA6 व्यक्त गर्यौं, जसले फ्लोरोसेन्ट रूपमा माइक्रोट्यूब्युलहरू लेबल गर्दछ, कर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरूमा KAND 11 को प्रभाव मूल्याङ्कन गर्न।Cortical microtubule घनत्व छवि विश्लेषण प्रयोग गरी मूल्याङ्कन गरिएको थियो, जसले साइटोप्लाज्मिक पिक्सेलहरू बीच साइटोस्केलेटल पिक्सेलको प्रतिशतलाई परिमाणित गर्यो।परख परिणामहरूले देखायो कि 50 μM वा 100 μM KAND 11 को 1 घण्टाको लागि उपचार पछि, घनत्व क्रमशः 0.94 ± 0.74% वा 0.23 ± 0.28% मा घट्यो, जबकि कोशिकाहरूको घनत्व DMSO सँग उपचार गरिएको थियो। % (चित्र 7a)।यी नतिजाहरू Arabidopsis मा भएको अवलोकनसँग मिल्दोजुल्दो छन् कि KAND 11 उपचारले कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरू (चित्र 6b) को डिपोलिमराइजेशनलाई प्रेरित गर्छ।हामीले KAND 11 को समान एकाग्रताको साथ उपचार पछि GFP-ABD-लेबल गरिएको एक्टिन फिलामेन्टको साथ BY-2 लाइन पनि जाँच्यौं र KAND 11 उपचारले एक्टिन फिलामेन्टहरू बाधा पुर्‍याएको देख्यौं।1 घन्टाका लागि 50 μM वा 100 μM KAND 11 सँगको उपचारले एक्टिन फिलामेन्ट घनत्वलाई क्रमशः 1.20 ± 0.62% वा 0.61 ± 0.26% मा घटाएको छ, जबकि DMSO-उपचार गरिएका कोशिकाहरूमा घनत्व 1.69% F21 ± 0.26% थियो।7b)।यी नतिजाहरू प्रोपाइजामाइडको प्रभावसँग विपरित छन्, जसले एक्टिन फिलामेन्टलाई असर गर्दैन, र ल्याट्रनकुलिन बी, एक्टिन डिपोलिमराइजर जसले माइक्रोट्यूब्युललाई असर गर्दैन (SI चित्र S6)।थप रूपमा, क्युमामोनामाइड 1, क्युमामोनामाइड एसिड 6, वा KAND 11 को उपचारले हेला कोशिकाहरूमा माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई असर गर्दैन (SI चित्र S7)।तसर्थ, KAND 11 को कार्यको संयन्त्र ज्ञात साइटोस्केलेटन अवरोधकहरू भन्दा फरक मानिन्छ।थप रूपमा, KAND 11 सँग उपचार गरिएको BY-2 कोशिकाहरूको हाम्रो सूक्ष्म अवलोकनले KAND 11 उपचारको क्रममा कोशिकाको मृत्युको सुरुवात भएको खुलासा गर्‍यो र केन्ड 11 उपचारको 30 मिनेट पछि इभान्स नीलो-दाग मृत कोशिकाहरूको अनुपातमा उल्लेखनीय वृद्धि भएको थिएन। 50 μM वा 100 μM KAND सँग उपचारको 90 मिनेट पछि, मृत कोशिकाहरूको संख्या क्रमशः 43.7% वा 80.1% मा बढ्यो (चित्र 7c)।सँगै लिइएको, यी डेटाले संकेत गर्दछ कि उपन्यास ursolic एसिड डेरिभेटिभ KAND 11 एक बिरुवा-विशिष्ट साइटोस्केलेटल अवरोधक कार्यको पहिले अज्ञात संयन्त्रको साथ हो।
KAND ले cortical microtubules, actin filaments, र तंबाकू BY-2 कोशिकाहरूको व्यवहार्यतालाई असर गर्छ।(a) TagRFP-TUA6 को उपस्थितिमा BY-2 कक्षहरूमा कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरूको दृश्य।KAND 11 (50 μM वा 100 μM) वा DMSO सँग उपचार गरिएको BY-2 कोशिकाहरू कन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा जाँच गरियो।कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युल घनत्व 25 स्वतन्त्र कक्षहरूको माइक्रोग्राफबाट गणना गरिएको थियो।अक्षरहरूले महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (Tukey HSD परीक्षण, p<०.०५)।स्केल बार = 10 µm।(b) BY-2 कोशिकाहरूमा Cortical actin filaments GFP-ABD2 को उपस्थितिमा कल्पना गरिएको।KAND 11 (50 μM वा 100 μM) वा DMSO सँग उपचार गरिएको BY-2 कोशिकाहरू कन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा जाँच गरियो।कोर्टिकल एक्टिन फिलामेन्टको घनत्व 25 स्वतन्त्र कक्षहरूको माइक्रोग्राफबाट गणना गरिएको थियो।अक्षरहरूले महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (Tukey HSD परीक्षण, p<०.०५)।स्केल बार = 10 µm।(c) इभान्स ब्लू स्टेनिङ द्वारा मृत BY-2 कोशिकाहरूको अवलोकन।KAND 11 (50 μM वा 100 μM) वा DMSO सँग उपचार गरिएका BY-2 कोशिकाहरूलाई उज्यालो-क्षेत्र माइक्रोस्कोपीद्वारा जाँच गरियो।n = 3।स्केल बार = 100 µm।
नयाँ प्राकृतिक उत्पादनहरूको आविष्कार र प्रयोगले औषधि र कृषि लगायत मानव जीवनका विभिन्न पक्षहरूमा महत्त्वपूर्ण प्रगति गरेको छ।प्राकृतिक स्रोतबाट उपयोगी यौगिकहरू प्राप्त गर्न ऐतिहासिक अनुसन्धान गरिएको छ।विशेष गरी, एक्टिनोमाइसेट्स निमाटोडका लागि एन्टिपरासिटिक एन्टिबायोटिकको रूपमा उपयोगी मानिन्छ किनभने तिनीहरूको विभिन्न माध्यमिक चयापचयहरू जस्तै एभरमेक्टिन, आइवरमेक्टिन र ब्लोमाइसिनको प्रमुख यौगिक र यसका डेरिभेटिभहरू उत्पादन गर्ने क्षमताको कारण, औषधीय रूपमा एन्टीक्यान्सर एजेन्टको रूपमा प्रयोग गरिन्छ।21,22।त्यस्तै गरी, एक्टिनोमाइसेट्सबाट विभिन्न प्रकारका जडिबुटीहरू पत्ता लगाइएको छ, जसमध्ये केही पहिले नै व्यावसायिक रूपमा १,२३ प्रयोग भइरहेका छन्।तसर्थ, प्राकृतिक उत्पादनहरूलाई वांछित जैविक गतिविधिहरूसँग अलग गर्न एक्टिनोमाइसेट मेटाबोलाइटहरूको विश्लेषणलाई प्रभावकारी रणनीति मानिन्छ।यस अध्ययनमा, हामीले S. werraensis बाट एउटा नयाँ यौगिक, क्युमामोनामाइड पत्ता लगायौं र यसलाई सफलतापूर्वक संश्लेषित गर्यौं।Ursonic एसिड urbenamide र यसको डेरिवेटिभ्स को एक सिंथेटिक मध्यवर्ती छ।यसले विशेष जरा कर्लिंग हुन सक्छ, मध्यम देखि बलियो जडीबुटी गतिविधि प्रदर्शन गर्न सक्छ, र प्रत्यक्ष वा अप्रत्यक्ष रूपमा बिरुवाको माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई क्षति पुर्‍याउँछ।जे होस्, urmotonic एसिड को कार्य को संयन्त्र अवस्थित microtubule inhibitors को भन्दा फरक हुन सक्छ, किनकि KAND 11 ले एक्टिन फिलामेन्टहरु लाई पनि बाधा पुर्‍याउँछ र कोशिकाको मृत्यु निम्त्याउँछ, एक नियामक संयन्त्रको सुझाव दिन्छ जसद्वारा urmotonic एसिड र यसको डेरिभेटिभले साइटोस्केलेटल संरचनाको विस्तृत श्रृंखलालाई प्रभाव पार्छ।।
urbenonic एसिड को थप विस्तृत विशेषताले urbenonic एसिड को कार्य को संयन्त्र राम्रोसँग बुझ्न मद्दत गर्नेछ।विशेष गरी, अर्को लक्ष्य भनेको अर्सोनिक एसिड र यसको डेरिभेटिभहरूले माइक्रोट्यूब्युलहरूमा सीधा कार्य गर्दछ र तिनीहरूलाई डिपोलिमराइज गर्दछ वा तिनीहरूको कार्यले माइक्रोट्यूब्युल अस्थिरतामा परिणाम दिन्छ कि भनेर निर्धारण गर्न कम माइक्रोट्यूब्युलहरूमा बाँध्न अर्सोनिक एसिडको क्षमताको मूल्याङ्कन गर्नु हो।थप रूपमा, माइक्रोट्यूब्युलहरू प्रत्यक्ष लक्ष्य नभएको अवस्थामा, बिरुवाको कोषहरूमा ursonic एसिडको कार्य स्थल र आणविक लक्ष्यहरू पहिचान गर्नाले सम्बन्धित यौगिकहरूको गुणहरू र जडीबुटी गतिविधि सुधार गर्ने सम्भावित तरिकाहरू बुझ्न मद्दत गर्नेछ।हाम्रो बायोएक्टिभिटी परखले अरबीडोप्सिस थालियाना, तंबाकू र लिभरवर्ट जस्ता बिरुवाहरूको वृद्धिमा अर्सोनिक एसिडको अद्वितीय साइटोटोक्सिक क्षमता प्रकट गर्‍यो, जबकि न त E. कोलाई न HeLa कोशिकाहरू प्रभावित भए।जनावरको कोषहरूमा थोरै वा कुनै विषाक्तता ursonic एसिड डेरिभेटिभहरूको फाइदा हो यदि तिनीहरूलाई खुला कृषि क्षेत्रहरूमा प्रयोगको लागि जडिबुटीको रूपमा विकसित गरिन्छ।वास्तवमा, युकेरियोटहरूमा माइक्रोट्यूब्युलहरू सामान्य संरचनाहरू भएकाले, वनस्पतिहरूमा तिनीहरूको चयनात्मक निषेध जडीबुटीको लागि मुख्य आवश्यकता हो।उदाहरणका लागि, प्रोपाइजामाइड, एक माइक्रोट्यूब्युल डिपोलिमराइजिंग एजेन्ट जसले ट्युब्युलिनसँग सीधै बाँध्छ र पोलिमराइजेशनलाई रोक्छ, जनावरको कोषहरूमा यसको कम विषाक्तताको कारणले हर्बिसाइडको रूपमा प्रयोग गरिन्छ24।Disopyramide को विपरीत, सम्बन्धित benzamides फरक लक्ष्य विशिष्टता छ।बिरुवाको माइक्रोट्यूब्युलका अतिरिक्त, RH-4032 वा बेन्जोक्सामाइडले क्रमशः जनावरको कोशिका वा oomycetes को माइक्रोट्यूब्युललाई पनि रोक्छ र जालिलामाइडलाई यसको कम फाइटोटोक्सिसिटी २५,२६,२७ को कारणले फङ्गिसाइडको रूपमा प्रयोग गरिन्छ।भर्खरै पत्ता लागेको भालु र यसको डेरिभेटिभहरूले बिरुवाहरू विरुद्ध चयनात्मक साइटोटोक्सिसिटी प्रदर्शन गर्दछ, तर यो ध्यान दिन लायक छ कि थप परिमार्जनहरूले तिनीहरूको लक्ष्य विशिष्टतालाई परिवर्तन गर्न सक्छ, सम्भावित रूपमा रोगजनक फंगी वा oomycetes को नियन्त्रणको लागि अतिरिक्त डेरिभेटिभहरू प्रदान गर्दछ।
अर्बेनोनिक एसिड र यसको डेरिभेटिभहरूको अद्वितीय गुणहरू जडिबुटीको रूपमा विकास गर्न र अनुसन्धान उपकरणको रूपमा प्रयोग गर्न उपयोगी छन्।बिरुवा कोष को आकार नियन्त्रण मा cytoskeleton को महत्व व्यापक रूपमा मान्यता प्राप्त छ।प्रारम्भिक अध्ययनहरूले देखाएको छ कि बिरुवाहरूले मोर्फोजेनेसिसलाई ठीकसँग नियन्त्रण गर्न माइक्रोट्यूब्युल गतिशीलता नियन्त्रण गरेर कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युल संगठनको जटिल संयन्त्रहरू विकसित गरेका छन्।माइक्रोट्यूब्युल गतिविधि को नियमन को लागी जिम्मेवार अणुहरु को एक ठूलो संख्या को पहिचान गरिएको छ, र सम्बन्धित अनुसन्धान अझै जारी छ 3,4,28।बिरुवाको कोशिकाहरूमा माइक्रोट्यूब्युल गतिशीलताको हाम्रो वर्तमान बुझाइले कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युल संगठनको संयन्त्रको पूर्ण रूपमा व्याख्या गर्दैन।उदाहरणका लागि, यद्यपि डिसोपाइरामाइड र ओरिजालिन दुवैले माइक्रोट्यूब्युलहरू डिपोलिमराइज गर्न सक्छन्, डिसोपायरमाइडले गम्भीर जरा विकृति निम्त्याउँछ जबकि ओरिजालिनको अपेक्षाकृत हल्का प्रभाव हुन्छ।यसबाहेक, ट्युब्युलिनमा उत्परिवर्तन, जसले माइक्रोट्यूब्युललाई स्थिर गर्दछ, पनि जरामा डेक्सट्रोरोटेशन निम्त्याउँछ, जबकि प्याक्लिटाक्सेल, जसले माइक्रोट्यूब्युल गतिशीलतालाई पनि स्थिर गर्दछ, गर्दैन।तसर्थ, ursolic एसिडको आणविक लक्ष्यहरूको अध्ययन र पहिचानले बिरुवाको कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलको नियमनमा नयाँ अन्तरदृष्टि प्रदान गर्नुपर्छ।त्यस्तै गरी, विकृत वृद्धिलाई बढावा दिन प्रभावकारी हुने रसायनहरूको भविष्यको तुलनाहरू, जस्तै डिसोपायरामाइड, र कम प्रभावकारी रसायनहरू, जस्तै ओरिजालिन वा कुमामोटोरिक एसिडले कसरी विकृत वृद्धि हुन्छ भन्ने संकेत प्रदान गर्नेछ।
अर्कोतर्फ, रक्षा-सम्बन्धित साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्थापनहरू अर्सोनिक एसिडको साइटोटोक्सिसिटी व्याख्या गर्न अर्को सम्भावना हो।रोगजनकको संक्रमण वा बिरुवाको कोशिकाहरूमा एलिसिटरको परिचयले कहिलेकाहीं साइटोस्केलेटनको विनाश र त्यसपछिको कोशिकाको मृत्यु 29 निम्त्याउँछ।उदाहरण को लागी, oomycete-व्युत्पन्न क्रिप्टोक्सान्थिनले तंबाकू कोशिकाको मृत्यु हुनु अघि माइक्रोट्यूब्युल र एक्टिन फिलामेन्टलाई बाधा पुर्‍याउने रिपोर्ट गरिएको छ, जसरी KAND उपचार 30,31 सँग हुन्छ।रक्षा प्रतिक्रियाहरू र ursonic एसिड द्वारा प्रेरित सेलुलर प्रतिक्रियाहरू बीच समानताहरूले हामीलाई परिकल्पना गर्न नेतृत्व गर्यो कि तिनीहरूले साझा सेलुलर प्रक्रियाहरू ट्रिगर गर्छन्, यद्यपि क्रिप्टोक्सान्थिन भन्दा ursonic एसिडको छिटो र बलियो प्रभाव स्पष्ट छ।यद्यपि, अध्ययनहरूले देखाएको छ कि एक्टिन फिलामेन्टको अवरोधले सहज कोशिकाको मृत्युलाई बढावा दिन्छ, जुन सधैं माइक्रोट्यूब्युल अवरोध 29 सँगसँगै हुँदैन।थप रूपमा, यो देख्न बाँकी छ कि या त रोगजनक वा एलिसिटरले विकृत जराको वृद्धि निम्त्याउँछ, जस्तै ursonic एसिड डेरिभेटिभहरू।तसर्थ, रक्षा प्रतिक्रियाहरू र साइटोस्केलेटनलाई जोड्ने आणविक ज्ञान सम्बोधन गर्न एक आकर्षक समस्या हो।अर्सोनिक एसिडसँग सम्बन्धित कम आणविक तौल यौगिकहरूको उपस्थितिको शोषण गरेर, साथसाथै विभिन्न क्षमताहरूसँग डेरिभेटिभहरूको दायरा, तिनीहरूले अज्ञात सेलुलर संयन्त्रहरूलाई लक्षित गर्ने अवसरहरू प्रदान गर्न सक्छन्।
सँगै लिएर, नयाँ यौगिकहरूको खोज र प्रयोग जसले माइक्रोट्यूब्युल गतिशीलतालाई परिमार्जन गर्दछ, जटिल आणविक संयन्त्रहरू अन्तर्निहित बिरुवा सेल आकार निर्धारणलाई सम्बोधन गर्न शक्तिशाली विधिहरू प्रदान गर्दछ।यस सन्दर्भमा, भर्खरै विकसित कम्पाउन्ड urmotonic एसिड, जसले माइक्रोट्यूब्युल र एक्टिन फिलामेन्टहरूलाई असर गर्छ र कोशिकाको मृत्युलाई प्रेरित गर्दछ, माइक्रोट्यूब्युल नियन्त्रण र यी अन्य संयन्त्रहरू बीचको सम्बन्ध बुझ्ने अवसर प्रदान गर्न सक्छ।यसैले, urbenonic एसिड प्रयोग गरेर रासायनिक र जैविक विश्लेषणले हामीलाई प्लान्ट साइटोस्केलेटन नियन्त्रण गर्ने आणविक नियामक संयन्त्रहरू बुझ्न मद्दत गर्नेछ।
2% (w/v) ग्यालेक्टोज, 2% (w/v) एसेन्स पेस्ट, 1% (w/v) ब्याक्टो कम्पोस समावेश भएको 110 mL बीज माध्यम भएको ५०० एमएल बाफ्ल्ड एर्लेनमेयर फ्लास्कमा एस. वेरेन्सिस MK493-CF1 इनोक्युलेट गर्नुहोस्। ।-सोयटन (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, इंक.), ०.५% (w/v) मकैको एक्स्ट्र्याक्ट (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), ०.२% (w/v) (NH4)2SO4 र ०.२% CaCO3 विआयनीकृत पानीमा।(pH 7.4 नसबंदी अघि)।बीउ कल्चरहरू रोटरी शेकर (180 rpm) मा 27 डिग्री सेल्सियसमा 2 दिनको लागि इन्क्युबेटेड थिए।ठोस अवस्था किण्वन मार्फत उत्पादन खेती।बीउ कल्चर (७ एमएल) लाई 500 एमएल K-1 फ्लास्कमा स्थानान्तरण गरिएको थियो जसमा 15 ग्राम प्रेस्ड जौ (MUSO Co., Ltd., Japan) र 25 ग्राम विआयनीकृत पानी (pH समायोजन नगरिएको) समावेश गरी 40 ग्राम उत्पादन माध्यम समावेश गरिएको थियो। नसबंदी अघि)।)।14 दिनको लागि अँध्यारोमा 30 डिग्री सेल्सियसमा किण्वन गरिन्छ।किण्वन सामग्री 40 एमएल / बोतल EtOH र सेन्ट्रीफ्यूज (1500 ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनेट) को साथ निकालिएको थियो।10% MeOH/EtOAc को मिश्रणको साथ कल्चर सुपरनेटेन्ट (60 एमएल) निकालिएको थियो।अवशेष (५९.५ मिलीग्राम) प्राप्त गर्नका लागि कम दबाबमा जैविक तहलाई वाष्पीकरण गरिएको थियो, जसलाई रिभर्स फेज स्तम्भ (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID) मा ग्रेडियन्ट इल्युसन (0-10 मिनेट: 90%) सँग HPLC को अधीनमा थियो। 10 मिमी × लम्बाइ 250 मिमी) H2O/CH3CN, 10-35 मिनेट: 90% H2O/CH3CN देखि 70% H2O/CH3CN (ग्रेडियन्ट), 35-45 मिनेट: 90% H2O/EtOH, 45-155 मिनेट: 90% H2 /EtOH बाट 100% EtOH (ग्रेडियन्ट (ग्रेडियन्ट), 155-200 मिनेट: 100% EtOH) 1.5 ml/min को प्रवाह दरमा, coumamonamide (1, 36.0 mg) सेतो अमोर्फस पाउडरको रूपमा अलग गरिएको थियो।
कुमामोटोमाइड (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H)।), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ गणना गरिएको मान: 141.0659, मापन गरिएको मान: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1373 सेमी।
कोलम्बिया बीज (Col-0) अनुसन्धान प्रयोगको लागि अनुमति संग Arabidopsis जैविक संसाधन केन्द्र (ABRC) बाट प्राप्त गरिएको थियो।Col-0 बीउहरू हाम्रो प्रयोगशालाको अवस्था अन्तर्गत प्रचार र मर्मत गरियो र जंगली-प्रकार Arabidopsis बिरुवाहरूको रूपमा प्रयोग गरियो।Arabidopsis बीउहरू सतहमा बाँझ र आधा-शक्तिको मुराशिगे र स्कुग माध्यममा 2% सुक्रोज (फुजीफिल्म वाको शुद्ध रसायन), 0.05% (w/v) 2- (4-मोर्फोलिनो) एथेनेसल्फोनिक एसिड (MES) (फुजीफिल्म वाको प्यूर चेमिकल) समावेश गरिएको थियो। )।) र 1.5% अगर (फुजीफिल्म वाको शुद्ध रसायन), pH 5.7, 23 डिग्री सेल्सियस र स्थिर प्रकाश।phs1-1 mutant को बीउ T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) ले उपलब्ध गराएको थियो।
टी. हाशिमोटो (नारा इन्स्टिच्युट अफ साइन्स एन्ड टेक्नोलोजी) द्वारा स्ट्रेन एसआर-१ को बीउ उपलब्ध गराइएको थियो र जंगली प्रकारको सुर्तीजन्य बिरुवाको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।तंबाकूको बीउलाई सतहमा बाँझ राखिएको थियो र अंकुरणलाई बढावा दिन बाँझरहित पानीमा तीन रात भिजाइएको थियो, त्यसपछि २% सुक्रोज, ०.०५% (w/v) MES, र ०.८% जेलन गम (फुजीफिल्म वाको शुद्ध रसायन) भएको आधा-शक्तिको घोलमा राखिएको थियो। मुरासिगे।र Skoog मध्यम) pH 5.7 भएको र स्थिर प्रकाशमा 23°C मा इन्क्युटेड हुन्छ।
Strain Tak-1 T. Kohchi (क्योटो विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान गरिएको थियो र लिभरवर्ट अध्ययनको लागि मानक प्रयोगात्मक एकाइको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।जेम्मालाई निर्जंतुकीकरण गरिएको कल्चर गरिएको बिरुवाबाट प्राप्त गरिएको थियो र त्यसपछि 1% सुक्रोज र 0.3% गेलन गम भएको गाम्बर्ग B5 माध्यम (फुजीफिल्म वाको शुद्ध रसायन) मा प्लेट गरिएको थियो र लगातार प्रकाशमा 23 डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेटेड हुन्छ।
तंबाकू BY-2 कोशिकाहरू (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa (टोकियो विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान गरिएको थियो।BY-2 कोशिकाहरूलाई परिमार्जित Linsmeier र Skoog माध्यममा 95-गुणा पातलो गरियो र 2,4-dichlorophenoxyacetic एसिड 32 सँग साप्ताहिक रूपमा पूरक गरियो।सेल निलम्बन अँध्यारोमा 27 डिग्री सेल्सियसमा 130 rpm मा रोटरी शेकरमा मिसाइएको थियो।ताजा माध्यमको १० गुणा भोल्युमको साथ कक्षहरू धुनुहोस् र उही माध्यममा पुन: सस्पेन्ड गर्नुहोस्।BY-2 ट्रान्सजेनिक सेल लाइनहरू स्थिर रूपमा माइक्रोट्यूब्युल मार्कर TagRFP-TUA6 वा एक्टिन फिलामेन्ट मार्कर GFP-ABD2 फूलगोभी मोजाइक भाइरस 35S प्रवर्द्धक अन्तर्गत 33,34,35 वर्णन गरिए अनुसार उत्पन्न गरियो।यी सेल लाइनहरू मौलिक BY-2 सेल लाइनका लागि प्रयोग गरिएका जस्तै प्रक्रियाहरू प्रयोग गरेर कायम राख्न र सिङ्क्रोनाइज गर्न सकिन्छ।
हेला कोशिकाहरू Dulbecco को परिमार्जित ईगलको माध्यम (DMEM) (लाइफ टेक्नोलोजी) मा 10% भ्रूण बोवाइन सीरम, 1.2 U/ml पेनिसिलिन, र 1.2 μg/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन 37 ° C %2 को इन्क्युबेटरमा पूर्ति गरिएको थियो।
यस पाण्डुलिपिमा वर्णन गरिएका सबै प्रयोगहरू जापानी जैव सुरक्षा नियमहरू र दिशानिर्देशहरू अनुसार गरिएको थियो।
यौगिकहरू स्टक समाधानको रूपमा डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO; फुजीफिल्म वाको शुद्ध रसायन) मा भंग गरियो र एराबिडोप्सिस र तंबाकू वा लिभरवर्टको लागि ग्याम्बर्ग B5 माध्यमको लागि एमएस माध्यममा पातलो गरियो।जराको वृद्धि अवरोध परखको लागि, संकेतित यौगिकहरू वा DMSO भएको अग्र माध्यममा प्रति प्लेट १० भन्दा बढी बीउहरू छरिएका थिए।बीउहरू 7 दिनको लागि ग्रोथ चेम्बरमा इन्क्युबेटेड थिए।बिरुवाको फोटो खिचियो र जराको लम्बाइ नापियो।Arabidopsis अंकुरण परखको लागि, 200 μM कम्पाउन्ड वा DMSO भएको अगर माध्यममा प्रति प्लेट ४८ वटा बीउ छरिएको थियो।Arabidopsis बीउहरू वृद्धि कक्षमा हुर्काइयो र अंकुरित बिरुवाहरूको संख्या अंकुरण (डेग) पछि 7 दिन गणना गरियो।तंबाकू अंकुरण परीक्षणको लागि, प्रति प्लेट २४ वटा बीउ 200 μM KAND वा DMSO भएको अगर माध्यममा छरिएको थियो।सुर्तीको बीउलाई ग्रोथ चेम्बरमा उब्जाइएको थियो र 14 दिन पछि अंकुरित बिरुवाहरूको संख्या गणना गरिएको थियो।लिभरवर्ट वृद्धि अवरोध परखका लागि, प्रत्येक प्लेटबाट 9 वटा भ्रूणलाई आगर माध्यममा प्लेट गरिएको थियो जसमा KAND वा DMSO को संकेत गरिएको सांद्रता समावेश थियो र 14 दिनको लागि वृद्धि कक्षमा इन्क्युबेटेड थियो।
जरा मेरिस्टेम संगठनको कल्पना गर्न 5 mg/ml प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) को दाग भएको बिरुवा प्रयोग गर्नुहोस्।PI संकेतहरू एक TCS SPE कन्फोकल लेजर स्क्यानिङ माइक्रोस्कोप (Leica Microsystems) को प्रयोग गरेर फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोपी द्वारा अवलोकन गरियो।
β-glucuronidase (GUS) को साथ जराको हिस्टोकेमिकल दाग मलामी र Benfey36 द्वारा वर्णन गरिएको प्रोटोकल अनुसार प्रदर्शन गरिएको थियो।बिरुवालाई रातभर ९०% एसीटोनमा ०.५ mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic एसिडले GUS बफरमा १ घण्टाको लागि दाग गरी हाइड्रेटेड क्लोराल्डिहाइड घोलमा राखिएको थियो।(8 ग्राम क्लोरल हाइड्रेट, 2 एमएल पानी र 1 एमएल ग्लिसरोल) र एक्सियो इमेजर M1 माइक्रोस्कोप (कार्ल जेइस) को प्रयोग गरेर भिन्नता हस्तक्षेप कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा अवलोकन गरियो।
जरा कोण ठाडो रूपमा राखिएको प्लेटहरूमा बढेको 7-दिन पुरानो बिरुवाहरूमा मापन गरियो।चरण 6 मा वर्णन गरिए अनुसार गुरुत्वाकर्षण भेक्टरको दिशाबाट रूटको कोण नाप्नुहोस्।
प्रोटोकल 37 मा सानो परिमार्जन संग, वर्णन गरिए अनुसार cortical microtubules को व्यवस्था अवलोकन गरिएको थियो।एन्टी-बीटा-ट्यूब्युलिन एन्टिबडी (KMX-1, मर्क मिलिपोर: MAB3408) र Alexa Fluor 488-conjugated एन्टि-माउस IgG (थर्मो फिशर वैज्ञानिक: A32723) 1:1000 र 1:100 dilution मा प्राथमिक र माध्यमिक एन्टिबडीहरूको रूपमा प्रयोग गरियो। क्रमशः।फ्लोरोसेन्स छविहरू TCS SPE कन्फोकल लेजर स्क्यानिङ माइक्रोस्कोप (Leica Microsystems) को प्रयोग गरेर प्राप्त गरियो।Z-स्ट्याक छविहरू प्राप्त गर्नुहोस् र निर्माताको निर्देशन अनुसार अधिकतम तीव्रता अनुमानहरू सिर्जना गर्नुहोस्।
HeLa सेल प्रसार परख निर्माताको निर्देशन अनुसार सेल काउन्टिंग किट 8 (डोजिन्डो) प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो।
E. coli DH5α को वृद्धि 600 nm (OD600) मा स्पेक्ट्रोफोटोमिटर प्रयोग गरेर संस्कृतिमा सेल घनत्व मापन गरेर विश्लेषण गरिएको थियो।
ट्रान्सजेनिक BY-2 कोशिकाहरूमा साइटोस्केलेटल संगठन CSU-X1 कन्फोकल स्क्यानिङ उपकरण (योकोगावा) र एक sCMOS क्यामेरा (Zyla, Andor टेक्नोलोजी) संग सुसज्जित फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोप प्रयोग गरी अवलोकन गरियो।साइटोस्केलेटल घनत्व छवि विश्लेषण द्वारा मूल्याङ्कन गरिएको थियो, जसले 38,39 वर्णन गरि ImageJ सफ्टवेयर प्रयोग गरेर कन्फोकल छविहरूमा साइटोस्केलेटल पिक्सेलहरू बीच साइटोस्केलेटल पिक्सेलको प्रतिशतलाई परिमाणित गर्‍यो।
BY-2 कोशिकाहरूमा कोशिकाको मृत्यु पत्ता लगाउन, कक्षको तापक्रममा 0.05% इभान्स नीलोसँग 10 मिनेटको लागि सेल सस्पेन्सनको एलीकोट इनक्यूबेटेड थियो।मृत कोशिकाहरूको चयनात्मक इभान्स नीलो दाग अक्षुण्ण प्लाज्मा झिल्ली द्वारा व्यवहार्य कोशिकाहरूबाट डाईको बाहिर निकाल्नमा निर्भर गर्दछ।दाग कोशिकाहरू उज्ज्वल-फिल्ड माइक्रोस्कोप (BX53, ओलम्पस) प्रयोग गरेर अवलोकन गरियो।
HeLa कोशिकाहरू DMEM मा 10% FBS को साथ 37°C र 5% CO2 मा आर्द्रतायुक्त इनक्यूबेटरमा बढाइएको थियो।कोशिकाहरूलाई 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), वा 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) को 37 डिग्री सेल्सियसमा 6 घण्टाको लागि उपचार गरियो।कक्षहरू 10 मिनेटको लागि MetOH सँग र त्यसपछि कोठाको तापमानमा 5 मिनेटको लागि एसीटेटको साथ फिक्स गरियो।स्थिर कोशिकाहरूलाई β-ट्यूब्युलिन प्राइमरी एन्टिबडी (1D4A4, प्रोटिनटेक: 66240-1) 0.5% BSA/PBS मा २ घण्टासम्म पातलो पारिएको, TBST सँग ३ पटक धोएर एलेक्सा फ्लोर गोट एन्टिबडीसँग इन्क्युबेटेड गरियो।488 1 घण्टा।- माउस IgG (थर्मो फिशर वैज्ञानिक: A11001) र 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.5% BSA/PBS मा पातलो।TBST ले तीन पटक धोएपछि, दाग कोशिकाहरू Nikon Eclipse Ti-E उल्टो माइक्रोस्कोपमा अवलोकन गरियो।MetaMorph सफ्टवेयर (आण्विक यन्त्रहरू) प्रयोग गरेर चिसो हमामात्सु ORCA-R2 CCD क्यामेराको साथ छविहरू खिचिएको थियो।