बिरुवाको सूक्ष्म नलीहरूलाई असर गर्ने नयाँ बिरुवा वृद्धि अवरोधकहरूको रूपमा उर्सा मोनोअमाइडहरूको खोज, विशेषता र कार्यात्मक सुधार।

Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद। तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजरको संस्करणमा सीमित CSS समर्थन छ। उत्कृष्ट परिणामहरूको लागि, हामी तपाईंलाई आफ्नो ब्राउजरको नयाँ संस्करण प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम पार्नुहोस्)। यसैबीच, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी स्टाइलिङ वा जाभास्क्रिप्ट बिना साइट देखाउँदैछौं।
प्राकृतिक उत्पादनहरूको खोज र लाभदायक प्रयोगले मानव जीवन सुधार गर्न मद्दत गर्न सक्छ। झारपात नियन्त्रण गर्न बिरुवाको वृद्धि निरोधक रसायनहरू व्यापक रूपमा झारनाशकको ​​रूपमा प्रयोग गरिन्छ। विभिन्न प्रकारका झारनाशकहरू प्रयोग गर्ने आवश्यकताको कारणले गर्दा, कार्यको नयाँ संयन्त्र भएका यौगिकहरू पहिचान गर्न आवश्यक छ। यस अध्ययनमा, हामीले स्ट्रेप्टोमाइसेस वेरेन्सिस MK493-CF1 बाट एक उपन्यास N -alkoxypyrole यौगिक, coumamonamide पत्ता लगायौं र पूर्ण संश्लेषण प्रक्रिया स्थापित गर्यौं। जैविक गतिविधि परीक्षणहरू मार्फत, हामीले पत्ता लगायौं कि urs-monoamic एसिड urs-monoamide को एक कृत्रिम मध्यवर्ती हो र सम्भाव्यताबिरुवा वृद्धि अवरोधक। यसका साथै, हामीले विभिन्न अर्बेनोनिक एसिड डेरिभेटिभहरू विकास गरेका छौं, जसमा अर्बेनिलोक्सी डेरिभेटिभ (UDA) समावेश छ, जसमा HeLa कोषहरूको वृद्धिलाई नकारात्मक असर नगरी उच्च जडीबुटीनाशक गतिविधि हुन्छ। हामीले यो पनि फेला पार्यौं कि अर्मोटोनिक एसिड डेरिभेटिभहरूले बिरुवाको सूक्ष्म नलीहरूलाई बाधा पुर्‍याउँछन्; यसको अतिरिक्त, KAND ले एक्टिन फिलामेन्टहरूलाई असर गर्छ र कोष मृत्युलाई प्रेरित गर्छ; यी बहुआयामिक प्रभावहरू ज्ञात माइक्रोट्यूब्युल अवरोधकहरू भन्दा फरक छन् र अर्सोनिक एसिडको लागि कार्यको नयाँ संयन्त्र सुझाव दिन्छन्, जसले नयाँ जडीबुटीहरूको विकासमा महत्त्वपूर्ण फाइदा प्रतिनिधित्व गर्दछ।
लाभदायक प्राकृतिक उत्पादनहरू र तिनीहरूका डेरिभेटिभहरूको खोज र व्यावहारिक प्रयोग मानव जीवनको गुणस्तर सुधार गर्ने माध्यम हो। सूक्ष्मजीवहरू, बोटबिरुवाहरू र कीराहरूद्वारा उत्पादित माध्यमिक मेटाबोलाइटहरूले औषधि र कृषिमा ठूलो प्रगति गरेका छन्। प्राकृतिक उत्पादनहरूबाट धेरै एन्टिबायोटिक र एन्टी-ल्युकेमिया औषधिहरू विकास गरिएका छन्। यसको अतिरिक्त, विभिन्न प्रकारकाकीटनाशकहरू, फङ्गिसाइड र झारनाशकहरू कृषिमा प्रयोगको लागि यी प्राकृतिक उत्पादनहरूबाट निकालिन्छन्। विशेष गरी, आधुनिक कृषिमा बाली उत्पादन बढाउन झार नियन्त्रण झारनाशकहरू महत्त्वपूर्ण उपकरणहरू हुन्, र विभिन्न प्रकारका यौगिकहरू पहिले नै व्यावसायिक रूपमा प्रयोग गरिन्छ। प्रकाश संश्लेषण, एमिनो एसिड चयापचय, कोशिका भित्ता संश्लेषण, माइटोसिसको नियमन, फाइटोहर्मोन सिग्नलिङ, वा प्रोटीन संश्लेषण जस्ता बिरुवाहरूमा धेरै कोशिका प्रक्रियाहरूलाई झारनाशकहरूको विशिष्ट लक्ष्य मानिन्छ। माइक्रोट्यूब्युल प्रकार्यलाई रोक्ने यौगिकहरू झारनाशकहरूको एक सामान्य वर्ग हो जसले माइटोटिक नियमनलाई असर गरेर बिरुवाको वृद्धिलाई असर गर्छ।
माइक्रोट्यूब्युलहरू साइटोस्केलेटनका घटक हुन् र युकेरियोटिक कोषहरूमा व्यापक रूपमा संरक्षित हुन्छन्। ट्युबुलिन हेटेरोडाइमरमा α-ट्युबुलिन र β-ट्युबुलिन हुन्छन् जसले रेखीय माइक्रोट्यूब्युल प्रोटोफिलामेन्ट बनाउँछन्, जसमा १३ प्रोटोफिलामेन्टहरू बेलनाकार संरचना बनाउँछन्। बिरुवाको कोषहरूमा माइक्रोट्यूब्युलहरूले धेरै भूमिका खेल्छन्, जसमा कोषको आकार निर्धारण गर्ने, कोष विभाजन गर्ने, र इन्ट्रासेलुलर ट्रान्सपोर्ट गर्ने समावेश छ। बिरुवाको कोषहरूमा इन्टरफेस प्लाज्मा झिल्ली मुनि माइक्रोट्यूब्युलहरू हुन्छन्, र यी तथाकथित कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरूले सेल्युलोज सिन्थेज कम्प्लेक्सहरू ४,५ को नियमन मार्फत सेल्युलोज माइक्रोफाइब्रिलहरूको संगठनलाई नियन्त्रण गर्ने सोचाइ छ। जराको टुप्पोको द्रुत लम्बाइको क्षेत्रमा अवस्थित जरा एपिडर्मल कोषहरूको कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरू पार्श्व रूपमा अवस्थित हुन्छन्, र सेलुलोज माइक्रोफाइबरहरूले यी माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई पछ्याउँछन् र कोष विस्तारको दिशा सीमित गर्छन्, जसले गर्दा एनिसोट्रोपिक कोष लम्बाइलाई बढावा दिन्छन्। त्यसकारण, माइक्रोट्यूब्युल प्रकार्य बिरुवाको आकारविज्ञानसँग नजिकबाट सम्बन्धित छ। ट्युबुलिन एन्कोड गर्ने जीनहरूमा एमिनो एसिड प्रतिस्थापनले अराबिडोप्सिस ६,७ मा कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युल एरेहरूको विकृति र बायाँ वा दायाँ-पक्षीय वृद्धि निम्त्याउँछ। त्यस्तै गरी, माइक्रोट्यूब्युल-सम्बन्धित प्रोटीनहरूमा उत्परिवर्तन जसले माइक्रोट्यूब्युल गतिशीलतालाई नियमन गर्दछ, यसले पनि जराको विकृत वृद्धि ८,९,१०,११,१२,१३ निम्त्याउन सक्छ। यसको अतिरिक्त, डिस्ओपाइरामाइड, जसलाई प्रिटिलाक्लोर पनि भनिन्छ, जस्ता माइक्रोट्यूब्युल-विघटनकारी झारनाशकहरूसँग उपचार गर्दा पनि बायाँ-पक्षीय तिरछा जराको वृद्धि हुन्छ१४। यी तथ्याङ्कहरूले संकेत गर्छन् कि बिरुवाको वृद्धिको दिशा निर्धारण गर्न माइक्रोट्यूब्युल प्रकार्यको सटीक नियमन महत्त्वपूर्ण छ।
विभिन्न प्रकारका माइक्रोट्यूब्युल अवरोधकहरू पत्ता लगाइएका छन्, र यी औषधिहरूले साइटोस्केलेटल अनुसन्धान, साथै कृषि र चिकित्सामा महत्त्वपूर्ण योगदान पुर्‍याएका छन्। विशेष गरी, ओरिजालिन, डायनिट्रोएनिलिन यौगिकहरू, डिसोपाइरामाइड, बेन्जामाइड-सम्बन्धित यौगिकहरू, र तिनीहरूका एनालगहरूले माइक्रोट्यूब्युल कार्यलाई रोक्न सक्छन् र यसरी बिरुवाको वृद्धिलाई रोक्छन्। त्यसैले, तिनीहरू व्यापक रूपमा जडीबुटीको रूपमा प्रयोग गरिन्छ। यद्यपि, माइक्रोट्यूब्युलहरू बिरुवा र जनावरको कोषहरूको एक महत्त्वपूर्ण घटक भएकोले, धेरैजसो माइक्रोट्यूब्युल अवरोधकहरू दुवै कोष प्रकारका लागि साइटोटोक्सिक हुन्छन्। त्यसकारण, जडीबुटीको रूपमा तिनीहरूको मान्यता प्राप्त उपयोगिताको बावजुद, व्यावहारिक उद्देश्यका लागि सीमित संख्यामा एन्टिमाइक्रोट्यूब्युल एजेन्टहरू प्रयोग गरिन्छ।
स्ट्रेप्टोमाइसेस स्ट्रेप्टोमाइसेस परिवारको एक प्रजाति हो, जसमा एरोबिक, ग्राम-पोजिटिभ, फिलामेन्टस ब्याक्टेरिया समावेश छ र माध्यमिक मेटाबोलाइट्सको विस्तृत दायरा उत्पादन गर्ने क्षमताको लागि व्यापक रूपमा परिचित छ। त्यसैले, यसलाई नयाँ जैविक रूपमा सक्रिय प्राकृतिक उत्पादनहरूको सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण स्रोतहरू मध्ये एक मानिन्छ। हालको अध्ययनमा, हामीले कौमामोनामाइड नामक नयाँ यौगिक पत्ता लगायौं, जुन स्ट्रेप्टोमाइसेस वेरेन्सिस MK493-CF1 र S. वेरेन्सिस ISP 5486 बाट अलग गरिएको थियो। वर्णक्रमीय विश्लेषण र पूर्ण वर्णक्रमीय विश्लेषण प्रयोग गरेर, कौमामोनामाइडको संरचनाको विशेषता बनाइएको थियो र यसको अद्वितीय N-alkoxypyrrole कंकाल निर्धारण गरिएको थियो। संश्लेषण। उर्समोनोमाइड र यसको डेरिभेटिभहरूको सिंथेटिक मध्यवर्ती उर्समोनिक एसिडले लोकप्रिय मोडेल बिरुवा अराबिडोप्सिस थालियानाको वृद्धि र अंकुरणलाई रोकेको पाइयो। संरचना-गतिविधि सम्बन्ध अध्ययनमा, हामीले पत्ता लगायौं कि उर्सोनिक एसिडमा परिमार्जन गरिएको C9 भएको यौगिक, जसलाई उर्सोनिक एसिडको नोनाइलोक्सी डेरिभेटिभ (KAND) भनिन्छ, ले वृद्धि र अंकुरणमा अवरोधक प्रभावलाई उल्लेखनीय रूपमा बढाउँछ। उल्लेखनीय रूपमा, भर्खरै पत्ता लागेको बिरुवाको वृद्धि अवरोधकले सुर्ती र लिभरवर्टको वृद्धिलाई पनि असर गर्‍यो र ब्याक्टेरिया वा HeLa कोषहरूको लागि साइटोटोक्सिक थिएन। यसबाहेक, केही उर्मोटोनिक एसिड डेरिभेटिभहरूले विकृत जरा फेनोटाइपलाई प्रेरित गर्छन्, जसले यी डेरिभेटिभहरूलाई प्रत्यक्ष वा अप्रत्यक्ष रूपमा माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई असर गर्छ भन्ने संकेत गर्दछ। यस विचारसँग मेल खाने, इम्युनोहिस्टोकेमिकली वा फ्लोरोसेन्ट प्रोटीनहरूसँग लेबल गरिएका माइक्रोट्यूब्युलहरूको हाम्रो अवलोकनले संकेत गर्दछ कि KAND उपचारले माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई डिपोलिमराइज गर्दछ। थप रूपमा, कुमामोटोनिक एसिड डेरिभेटिभहरूसँगको उपचारले एक्टिन माइक्रोफिलामेन्टहरूलाई बाधा पुर्‍याउँछ। यसरी, हामीले एउटा नयाँ बिरुवाको वृद्धि अवरोधक पत्ता लगाएका छौं जसको कार्यको अद्वितीय संयन्त्रमा साइटोस्केलेटनको विनाश समावेश छ।
टोकियोको शिनागावा-कुमा रहेको माटोबाट स्ट्रेन MK493-CF1 लाई अलग गरिएको थियो। स्ट्रेन MK493-CF1 ले राम्रोसँग शाखा भएको स्ट्रोमल माइसेलियम बनायो। १६S राइबोसोमल आरएनए जीनको आंशिक अनुक्रम (१४२२ bp) निर्धारण गरिएको थियो। यो स्ट्रेन S. werraensis (NBRC १३४०४T = ISP ५४८६, १४२१/१४२२ bp, T: विशिष्ट स्ट्रेन, ९९.९३%) सँग धेरै मिल्दोजुल्दो छ। यस नतिजाको आधारमा, यो स्ट्रेन S. werraensis को प्रकार स्ट्रेनसँग नजिकबाट सम्बन्धित थियो भनेर निर्धारण गरिएको थियो। त्यसकारण, हामीले अस्थायी रूपमा यो स्ट्रेनलाई S. werraensis MK493-CF1 नाम दियौं। S. werraensis ISP ५४८६T ले पनि उही जैविक सक्रिय यौगिकहरू उत्पादन गर्दछ। यस सूक्ष्मजीवबाट प्राकृतिक उत्पादनहरू प्राप्त गर्ने बारेमा प्रारम्भिक अनुसन्धान थोरै भएकोले, थप रासायनिक अनुसन्धान गरिएको थियो। जौको माध्यममा S. werraensis MK493-CF1 लाई ३०°C मा ठोस-अवस्था किण्वनद्वारा १४ दिनसम्म खेती गरेपछि, माध्यमलाई ५०% EtOH सहित निकालियो। ५९.५ मिलीग्राम कच्चा अर्क प्राप्त गर्न ६० मिलीलीटर नमूना सुकाइयो। N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (१, नाम दिइएको coumamonamide, ३६.० मिलीग्राम) दिनको लागि कच्चा अर्कलाई उल्टो चरण HPLC मा राखिएको थियो। १ को कुल मात्रा कच्चा अर्कको लगभग ६०% हो। त्यसकारण, हामीले कुमामोटोआमाइड १ को गुणहरूको विस्तृत रूपमा अध्ययन गर्ने निर्णय गर्यौं।
Coumamonamide 1 एक सेतो अनाकार पाउडर हो र उच्च रिजोल्युसन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HRESIMS) ले C6H8N2O2 (चित्र १) पुष्टि गर्दछ। यस यौगिकको C2-प्रतिस्थापन गरिएको पाइरोल खण्ड δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH in 1H NMR स्पेक्ट्रम: 4.5 Hz, H-5) र δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) द्वारा विशेषता हो, र 13C NMR स्पेक्ट्रमले चार sp2 कार्बन परमाणुहरूको उपस्थिति देखाउँछ। C2 स्थितिमा एमाइड समूहको उपस्थिति δC 161.1 मा C-3 प्रोटोनबाट एमाइड कार्बोनिल कार्बनसँग HMBC सहसम्बन्ध द्वारा मूल्याङ्कन गरिएको थियो। यसको अतिरिक्त, δH 4.10 (3H, S) र δC 68.3 मा 1 H र 13 C NMR शिखरले अणुमा N-मेथोक्सी समूहहरूको उपस्थितिलाई संकेत गर्दछ। यद्यपि मेथोक्सी समूहको सही स्थिति अझैसम्म स्पेक्ट्रोस्कोपिक विश्लेषण जस्तै एन्हान्स्ड डिफरन्स स्पेक्ट्रोस्कोपी र न्यूक्लियर ओभरहाउसर संक्षिप्त नाम (NOEDF) प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थिएन, N-मेथोक्सी-1H-पाइरोल-2-कार्बोक्सामाइड पहिलो उम्मेदवार यौगिक बन्यो।
१ को सही संरचना निर्धारण गर्न, कुल संश्लेषण गरिएको थियो (चित्र २क)। व्यावसायिक रूपमा उपलब्ध २-एमिनोपायरिडिन २ को m-CPBA सँग उपचार गर्दा परिमाणात्मक उत्पादनमा सम्बन्धित N-अक्साइड ३ प्राप्त भयो। २ को २-एमिनोपायरिडिन पछि, अब्रामोभिचले वर्णन गरेको साइक्लोकन्डेन्सेसन प्रतिक्रिया ९० डिग्री सेल्सियसमा बेन्जिनमा गरिएको थियो ताकि इच्छित १-हाइड्रोक्सी-१एच-पाइरोल-२-कार्बोनिट्राइल ५ ग्राममा प्राप्त गर्न सकियोस्। गति ६०% (दुई चरण)। १५,१६। ४ को मेथिलेसन र हाइड्रोलिसिसले त्यसपछि १-मेथोक्सी-१एच-पाइरोल-२-कार्बोक्सिलिक एसिड ("क्युमोटोनिक एसिड" भनिन्छ, ६) राम्रो उत्पादनमा दियो (७०%, दुई चरण)। अन्तमा, जलीय अमोनिया प्रयोग गरेर एसिड क्लोराइड मध्यवर्ती ६ मार्फत एमिडेशनले ९८% उत्पादनमा कुमामोटो एमाइड १ दियो। संश्लेषित १ को सबै वर्णक्रमीय डेटा पृथक १ जस्तै थियो, त्यसैले १ को संरचना निर्धारण गरिएको थियो;
अर्बेनामाइड र अर्बेनिक एसिडको जैविक गतिविधिको सामान्य संश्लेषण र विश्लेषण। (क) कुमामोटो एमाइडको कुल संश्लेषण। (ख) सात दिन पुरानो जंगली प्रकारको एराबिडोप्सिस कोलम्बिया (कोल) बिरुवाहरू मुराशिगे र स्कूग (एमएस) प्लेटहरूमा उब्जाइएको थियो जसमा संकेत गरिएको सांद्रतामा कौमामोनामाइड ६ वा कौमामोनामाइड १ थियो। स्केल बार = १ सेमी।
पहिला, हामीले बिरुवाको वृद्धिलाई परिमार्जन गर्ने क्षमताको लागि अर्बेनामाइड र यसको मध्यवर्तीहरूको जैविक गतिविधिहरूको मूल्याङ्कन गर्यौं। हामीले एमएस अगर माध्यममा उर्समोनामाइड १ वा उर्समोनिक एसिड ६ को विभिन्न सांद्रता थप्यौं र यस माध्यममा अराबिडोप्सिस थालियाना बिरुवाहरू कल्चर गर्यौं। यी परीक्षणहरूले देखाए कि ६ को उच्च सांद्रता (५०० μM) ले जराको वृद्धिलाई रोक्छ (चित्र २b)। अर्को, हामीले ६ को N1 स्थिति प्रतिस्थापन गरेर विभिन्न डेरिभेटिभहरू उत्पन्न गर्यौं र तिनीहरूमा संरचना-गतिविधि सम्बन्ध अध्ययनहरू गर्यौं (एनालग संश्लेषण प्रक्रियालाई समर्थन जानकारी (SI) मा वर्णन गरिएको छ)। अराबिडोप्सिस बिरुवाहरू ५० μM उर्सोनिक एसिड डेरिभेटिभहरू भएको माध्यममा उब्जाइएको थियो, र जराको लम्बाइ मापन गरिएको थियो। चित्रमा देखाइए अनुसार। चित्र ३a, b, र S1 मा देखाइए अनुसार, कौमामो एसिडहरूमा N1 स्थितिमा रेखीय अल्कोक्सी चेनहरू (9, 10, 11, 12, र 13) वा ठूला अल्कोक्सी चेनहरू (15, 16, र 17) को फरक लम्बाइ हुन्छ। डेरिभेटिभहरूले जराको वृद्धिमा उल्लेखनीय अवरोध देखाए। यसको अतिरिक्त, हामीले पत्ता लगायौं कि २०० μM १०, ११, वा १७ को प्रयोगले अंकुरणलाई रोक्छ (चित्र ३c र S2)।
कुमामोटो एमाइड र सम्बन्धित यौगिकहरूको संरचना-गतिविधि सम्बन्धको अध्ययन। (क) एनालगहरूको संरचना र संश्लेषण योजना। (ख) ५० μM कुमामोनामाइड डेरिभेटिभहरू सहित वा बिना MS माध्यममा उब्जाइएको ७-दिन पुरानो बिरुवाहरूको जरा लम्बाइको परिमाण। ताराहरूले नक्कली उपचारसँग महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (t परीक्षण, p< ०.०५)। n>१८. डेटालाई औसत ± SD को रूपमा देखाइएको छ। nt को अर्थ "परीक्षण नगरिएको" हो किनभने ५०% भन्दा बढी बीउ अंकुरित भएन। (c) २०० μM कौमामोनामाइड र सम्बन्धित यौगिकहरू सहित वा बिना MS माध्यममा ७ दिनको लागि इन्क्युबेट गरिएको उपचार गरिएको बीउको अंकुरण दरको परिमाण। ताराहरूले नक्कली उपचार (ची-स्क्वायर परीक्षण) सँग महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ। n=९६।
चाखलाग्दो कुरा के छ भने, C9 भन्दा लामो अल्काइल साइड चेनहरू थप्दा निरोधात्मक गतिविधि कम भयो, जसले सुझाव दिन्छ कि कुमामोटोइक एसिड-सम्बन्धित यौगिकहरूलाई तिनीहरूको जैविक गतिविधि प्रदर्शन गर्न निश्चित आकारको साइड चेनहरू आवश्यक पर्दछ।
संरचना-गतिविधि सम्बन्ध विश्लेषणले C9 लाई ursonic एसिडमा परिमार्जन गरिएको र ursonic एसिडको nonyloxy व्युत्पन्न (यसपछि KAND 11 भनेर चिनिन्छ) सबैभन्दा प्रभावकारी बिरुवा वृद्धि अवरोधक भएको देखाएको हुनाले, हामीले KAND 11 को थप विस्तृत विशेषता सञ्चालन गर्यौं। 50 μM KAND 11 को साथ Arabidopsis को उपचारले लगभग पूर्ण रूपमा अंकुरणलाई रोक्यो, जबकि KAND 11 को कम सांद्रता (40, 30, 20, वा 10 μM) ले खुराक-निर्भर तरिकाले जराको वृद्धिलाई रोक्यो (चित्र 4a, b)। KAND 11 ले जरा मेरिस्टेम व्यवहार्यतालाई असर गर्छ कि गर्दैन भनेर परीक्षण गर्न, हामीले प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) ले दागिएका जरा मेरिस्टेमहरूको जाँच गर्यौं र मेरिस्टेम क्षेत्र आकार मापन गर्यौं। २५ μM KAND-11 भएको माध्यममा उब्जाइएको बिरुवाको मेरिस्टेमको आकार १५१.१ ± ३२.५ μm थियो, जबकि DMSO भएको नियन्त्रण माध्यममा उब्जाइएको बिरुवाको मेरिस्टेमको आकार २६४.७ ± ३०.८ μm थियो (चित्र ४c, d), जसले KAND-११ ले कोशिका गतिविधि पुनर्स्थापित गर्छ भन्ने संकेत गर्छ। फैलावट। जरा मेरिस्टेम। यससँग मिल्दोजुल्दो, KAND ११ उपचारले जरा मेरिस्टेममा कोशिका विभाजन मार्कर CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS संकेतको मात्रा घटायो (चित्र ४e) १७। यी परिणामहरूले संकेत गर्छन् कि KAND ११ ले कोशिका प्रसार गतिविधि घटाएर जराको वृद्धिलाई रोक्छ।
वृद्धिमा अर्बेनोनिक एसिड डेरिभेटिभ्स (अरबेनिलोक्सी डेरिभेटिभ्स) को निरोधात्मक प्रभावको विश्लेषण। (क) KAND ११ को संकेतित सांद्रता भएको MS प्लेटहरूमा उब्जाइएको ७-दिन पुरानो जंगली-प्रकारको कोल बिरुवा। स्केल बार = १ सेमी। (ख) जराको लम्बाइको परिमाण। अक्षरहरूले महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्छन् (टुकी एचएसडी परीक्षण, पृ.< ०.०५)। n>१६. डेटा औसत ± SD को रूपमा देखाइएको छ। (c) २५ μM KAND भएको वा बिना MS प्लेटहरूमा उब्जाइएको प्रोपिडियम आयोडाइड-दाग भएको जंगली-प्रकारको कोल जराको कन्फोकल माइक्रोस्कोपी ११. सेतो कोष्ठकले जरा मेरिस्टेमलाई संकेत गर्दछ। स्केल बार = १०० µm। (d) जरा मेरिस्टेम आकारको परिमाण (n = १० देखि ११)। तथ्याङ्कीय भिन्नताहरू t-परीक्षण (p) प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो।< ०.०५)। बारहरूले औसत मेरिस्टेम आकारलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। (ङ) CDKB2 कन्स्ट्रक्ट भएको रूट मेरिस्टेमको डिफरेंशियल इन्टरफेरन्स कन्ट्रास्ट (DIC) माइक्रोस्कोपी; १pro: CDKB2; २५ µM KAND परखको साथ वा बिना MS प्लेटहरूमा उब्जाइएको ५-दिन पुरानो बिरुवाहरूमा १-GUS दाग र दाग।
KAND 11 को फाइटोटोक्सिसिटी अर्को द्विदलीय बिरुवा, सुर्ती (निकोटियाना ट्याब्याकम), र एक प्रमुख भूमि बिरुवा मोडेल जीव, लिभरवर्ट (मार्चेन्टिया पोलिमोर्फा) प्रयोग गरेर थप परीक्षण गरिएको थियो। अरबिडोप्सिसको मामलामा जस्तै, २५ μM KAND 11 भएको माध्यममा उब्जाइएको सुर्ती SR-1 बिरुवाले छोटो जरा उत्पादन गर्‍यो (चित्र ५a)। थप रूपमा, ४८ मध्ये ४० बीउ २०० μM KAND 11 भएको प्लेटहरूमा अंकुरित भए, जबकि सबै ४८ बीउहरू नक्कली-उपचार गरिएको माध्यममा अंकुरित भए, जसले KAND को उच्च सांद्रता महत्त्वपूर्ण रहेको संकेत गर्दछ (p< ०.०५; ची टेस्ट -स्क्वायर) ले सुर्तीको अंकुरणलाई रोक्यो। (चित्र ५ख)। यसका साथै, लिभरवर्टमा ब्याक्टेरियाको वृद्धिलाई रोक्ने KAND ११ को सांद्रता Arabidopsis (चित्र ५ग) मा प्रभावकारी सांद्रता जस्तै थियो। यी नतिजाहरूले KAND ११ ले विभिन्न प्रकारका बोटबिरुवाहरूको वृद्धिलाई रोक्न सक्छ भन्ने संकेत गर्छ। त्यसपछि हामीले उच्च जनावर र ब्याक्टेरिया कोषहरूको प्रतिनिधिको रूपमा क्रमशः अन्य जीवहरू, अर्थात् मानव HeLa कोषहरू र Escherichia coli स्ट्रेन DH5α मा भालु मोनोअमाइड-सम्बन्धित यौगिकहरूको सम्भावित साइटोटोक्सिसिटीको अनुसन्धान गर्यौं। कोशिका प्रसार परीक्षणहरूको श्रृंखलामा, हामीले अवलोकन गर्यौं कि coumamonamide 1, coumamonamidic एसिड 6, र KAND 11 ले १०० μM को सांद्रतामा HeLa वा E. coli कोषहरूको वृद्धिलाई असर गरेनन् (चित्र ५घ,e)।
गैर-अराबिडोप्सिस जीवहरूमा KAND 11 को वृद्धि अवरोध। (क) दुई हप्ता पुरानो जंगली-प्रकार SR-1 सुर्तीजन्य बिरुवाहरू 25 μM KAND 11 भएको ठाडो रूपमा राखिएको MS प्लेटहरूमा उब्जाइएको थियो। (ख) दुई हप्ता पुरानो जंगली-प्रकार SR-1 सुर्तीजन्य बिरुवाहरू 200 μM KAND 11 भएको तेर्सो रूपमा राखिएको MS प्लेटहरूमा उब्जाइएको थियो। (ग) KAND 11 को संकेतित सांद्रता भएको Gamborg B5 प्लेटहरूमा उब्जाइएको दुई हप्ता पुरानो जंगली-प्रकार Tak-1 लिभरवर्ट कोपिलाहरू। रातो तीरहरूले दुई हप्ताको इन्क्युबेशन अवधि भित्र बढ्न बन्द भएका बीजाणुहरूलाई संकेत गर्दछ। (घ) HeLa कोषहरूको कोष प्रसार परख। कोष गणना किट 8 (Dojindo) प्रयोग गरेर निश्चित समय अन्तरालहरूमा व्यवहार्य कोषहरूको संख्या मापन गरिएको थियो। नियन्त्रणको रूपमा, HeLa कोषहरूलाई 5 μg/ml एक्टिनोमाइसिन D (Act D) ले उपचार गरिएको थियो, जसले RNA पोलिमरेज ट्रान्सक्रिप्शनलाई रोक्छ र कोष मृत्यु निम्त्याउँछ। विश्लेषणहरू तीन प्रतिकृतिमा गरिएको थियो। (ङ) E. कोलाई कोष प्रसार परख। OD600 मापन गरेर E. coli को वृद्धिको विश्लेषण गरिएको थियो। नियन्त्रणको रूपमा, कोषहरूलाई 50 μg/ml एम्पिसिलिन (Amp) ले उपचार गरिएको थियो, जसले ब्याक्टेरियाको कोष भित्ता संश्लेषणलाई रोक्छ। विश्लेषणहरू तीन प्रतिलिपिमा गरिएको थियो।
युरामाइड-सम्बन्धित यौगिकहरूबाट हुने साइटोटोक्सिसिटीको कार्य संयन्त्र बुझ्नको लागि, हामीले मध्यम निरोधात्मक प्रभावहरू भएका अर्बेनिक एसिड डेरिभेटिभहरूको पुन: विश्लेषण गर्यौं। चित्रमा देखाइएझैं। चित्र २b, ६a मा देखाइएझैं, उर्मोटोनिक एसिड ६ को उच्च सांद्रता (२०० μM) भएको अगर प्लेटहरूमा उब्जाइएको बिरुवाहरूले छोटो र बायाँ-घुम्ने जराहरू (θ = – २३.७ ± ६.१) उत्पादन गरे, जबकि नियन्त्रण माध्यममा उब्जाइएको बिरुवाहरूको, बिरुवाहरूले लगभग सीधा जराहरू (θ = – ३.८ ± ७.१) उत्पादन गरे। यो विशेषता तिरछा वृद्धि कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरूको डिसफंक्शनको परिणाम हो भनेर थाहा छ। यस खोजसँग मिल्दोजुल्दो, माइक्रोट्यूब्युल-अस्थिर गर्ने औषधिहरू डिसोपाइरामाइड र ओरिजालिनले हाम्रो वृद्धि अवस्थाहरू अन्तर्गत समान जरा झुकावलाई प्रेरित गर्‍यो (चित्र २b, ६a)। एकै समयमा, हामीले उर्मोटोनिक एसिड डेरिभेटिभहरूको परीक्षण गर्यौं र तिनीहरूमध्ये धेरै चयन गर्यौं जसले निश्चित सांद्रतामा, तिरछा जराको वृद्धिलाई प्रेरित गर्‍यो। यौगिक ८, ९ र १५ ले जराको वृद्धिको दिशा क्रमशः ७५ μM, ५० μM र ४० μM मा परिवर्तन गर्‍यो, जसले यी यौगिकहरूले सूक्ष्म नलीहरूलाई प्रभावकारी रूपमा अस्थिर बनाउन सक्छन् भन्ने संकेत गर्छ (चित्र २b, ६a)। हामीले सबैभन्दा शक्तिशाली ursolic एसिड डेरिभेटिभ, KAND ११ लाई कम सांद्रता (१५ µM) मा पनि परीक्षण गर्‍यौं र पत्ता लगायौं कि KAND ११ को प्रयोगले जराको वृद्धिलाई रोक्छ र जराको वृद्धिको दिशा असमान थियो, यद्यपि तिनीहरू बायाँतिर ढल्कन्छन् (चित्र C3)। किनभने माइक्रोट्यूब्युल-अस्थिर गर्ने औषधिहरूको उच्च सांद्रताले कहिलेकाहीं जरा झुकाउनुको सट्टा बिरुवाको वृद्धिलाई रोक्छ, हामीले पछि जराको एपिडर्मल कोशिकाहरूमा कोर्टिकल सूक्ष्म नलीहरू अवलोकन गरेर KAND ११ ले सूक्ष्म नलीहरूलाई असर गर्ने सम्भावनाको मूल्याङ्कन गर्‍यौं। २५ μM KAND ११ ले उपचार गरिएको बिरुवाको जराको एपिडर्मल कोषहरूमा एन्टी-β-ट्युबुलिन एन्टिबडीहरू प्रयोग गर्ने इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्रीले लम्बाइ क्षेत्र (चित्र ६b) मा एपिडर्मल कोषहरूमा लगभग सबै कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरू गायब भएको देखाएको छ। यी नतिजाहरूले संकेत गर्छन् कि कुमामोटोनिक एसिड र यसका डेरिभेटिभहरूले माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई बाधा पुर्‍याउन प्रत्यक्ष वा अप्रत्यक्ष रूपमा कार्य गर्छन् र यी यौगिकहरू नयाँ माइक्रोट्यूब्युल अवरोधकहरू हुन्।
उर्सोनिक एसिड र यसका डेरिभेटिभहरूले अराबिडोप्सिस थालियानामा कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरू परिवर्तन गर्छन्। (क) संकेत गरिएको सांद्रतामा विभिन्न उर्मोटोनिक एसिड डेरिभेटिभहरूको उपस्थितिमा मापन गरिएको जरा झुकाव कोण। माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई रोक्न ज्ञात दुई यौगिकहरूको प्रभावहरू: डिसोपाइरामाइड र ओरिजालिन पनि विश्लेषण गरिएको थियो। इनसेटले जरा वृद्धि कोण मापन गर्न प्रयोग गरिने मानक देखाउँछ। ताराहरूले नक्कली उपचारसँग महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (t परीक्षण, p< ०.०५)। n>१९. स्केल बार = १ सेमी। (ख) लम्बाइ क्षेत्रमा एपिडर्मल कोशिकाहरूमा कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरू। २५ μM KAND ११ सहित वा बिना MS प्लेटहरूमा उब्जाइएको जंगली-प्रकारको एराबिडोप्सिस कोल जरामा माइक्रोट्यूब्युलहरू β-ट्युबुलिन प्राथमिक एन्टिबडीहरू र एलेक्सा फ्लोर-कन्जुगेटेड माध्यमिक एन्टिबडीहरू प्रयोग गरेर इम्युनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिङद्वारा दृश्यावलोकन गरिएको थियो। स्केल बार = १० µm। (ग) जरा मेरिस्टेममा माइक्रोट्यूब्युलहरूको माइटोटिक संरचना। इम्युनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिङ प्रयोग गरेर माइक्रोट्यूब्युलहरू दृश्यावलोकन गरिएको थियो। प्रोफेस जोनहरू, स्पिन्डलहरू, र फ्र्याग्मोप्लास्टहरू सहित माइटोटिक संरचनाहरू, कन्फोकल छविहरूबाट गणना गरिएको थियो। तीरहरूले माइटोटिक माइक्रोट्यूब्युल संरचनाहरू संकेत गर्दछ। ताराहरूले नक्कली उपचारसँग महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (t परीक्षण, p< ०.०५)। n>९. स्केल बार = ५० µm।
यद्यपि उर्सामा माइक्रोट्यूब्युलको कार्यलाई बाधा पुर्‍याउने क्षमता छ, यसको कार्य संयन्त्र सामान्य माइक्रोट्यूब्युल डिपोलिमराइजिंग एजेन्टहरू भन्दा फरक हुने अपेक्षा गरिएको छ। उदाहरणका लागि, डिसोपाइरामाइड र ओरिजालिन जस्ता माइक्रोट्यूब्युल डिपोलिमराइजिंग एजेन्टहरूको उच्च सांद्रताले एपिडर्मल कोषहरूको एनिसोट्रोपिक विस्तारलाई प्रेरित गर्छ, जबकि KAND 11 ले गर्दैन। थप रूपमा, KAND 11 र डिसोपाइरामाइडको सह-प्रयोगको परिणामस्वरूप संयुक्त डिसोपाइरामाइड-प्रेरित जरा वृद्धि प्रतिक्रिया र KAND 11-प्रेरित वृद्धि अवरोध अवलोकन गरियो (चित्र S4)। हामीले KAND 11 मा अतिसंवेदनशील डिसोपाइरामाइड 1-1 (phs1-1) उत्परिवर्तीको प्रतिक्रियाको पनि विश्लेषण गर्यौं। phs1-1 मा गैर-प्रामाणिक ट्युबुलिन किनेज पोइन्ट उत्परिवर्तन हुन्छ र डिसोपाइरामाइड9,20 सँग उपचार गर्दा छोटो जराहरू उत्पादन गर्दछ। KAND 11 भएको अगर माध्यममा उब्जाइएको phs1-1 उत्परिवर्ती बिरुवाहरूमा डिसोपाइरामिडमा उब्जाइएको जस्तै छोटो जराहरू थिए (चित्र S5)।
यसको अतिरिक्त, हामीले KAND 11 बाट उपचार गरिएका बिरुवाहरूको जरा मेरिस्टेममा प्रोफेस जोन, स्पिन्डल र फ्र्याग्मोप्लास्ट जस्ता माइटोटिक माइक्रोट्यूब्युल संरचनाहरू अवलोकन गर्यौं। CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS को लागि अवलोकनहरूसँग मेल खाने, माइटोटिक माइक्रोट्यूब्युलहरूको संख्यामा उल्लेखनीय कमी अवलोकन गरियो (चित्र .6c)।
सबसेलुलर रिजोलुसनमा KAND 11 को साइटोटोक्सिसिटीलाई चित्रण गर्न, हामीले KAND 11 सँग सुर्तीजन्य BY-2 सस्पेन्सन कोषहरूको उपचार गर्यौं र तिनीहरूको प्रतिक्रिया अवलोकन गर्यौं। हामीले पहिले KAND 11 लाई TagRFP-TUA6 व्यक्त गर्ने BY-2 कोषहरूमा थप्यौं, जसले फ्लोरोसेन्टली माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई लेबल गर्दछ, कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरूमा KAND 11 को प्रभावको मूल्याङ्कन गर्न। कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युल घनत्व छवि विश्लेषण प्रयोग गरेर मूल्याङ्कन गरिएको थियो, जसले साइटोप्लाज्मिक पिक्सेलहरू बीच साइटोस्केलेटल पिक्सेलको प्रतिशतको मात्रा निर्धारण गर्‍यो। परख परिणामहरूले देखाए कि 50 μM वा 100 μM KAND 11 सँग 1 घण्टाको लागि उपचार पछि, घनत्व क्रमशः 0.94 ± 0.74% वा 0.23 ± 0.28% मा उल्लेखनीय रूपमा घट्यो, जबकि DMSO सँग उपचार गरिएका कोषहरूको घनत्व, 1.61 ± 0.34% (चित्र 7a) थियो। यी नतिजाहरू Arabidopsis मा अवलोकनसँग मिल्दोजुल्दो छन् कि KAND 11 उपचारले कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरूको डिपोलिमराइजेशनलाई प्रेरित गर्दछ (चित्र 6b)। हामीले KAND 11 को समान सांद्रतासँग उपचार पछि GFP-ABD-लेबल गरिएको एक्टिन फिलामेन्टहरू सहित BY-2 लाइनको पनि जाँच गर्यौं र अवलोकन गर्यौं कि KAND 11 उपचारले एक्टिन फिलामेन्टहरूलाई बाधा पुर्‍यायो। १ घण्टाको लागि ५० μM वा १०० μM KAND 11 सँग उपचारले एक्टिन फिलामेन्ट घनत्वलाई क्रमशः १.२० ± ०.६२% वा ०.६१ ± ०.२६% मा उल्लेखनीय रूपमा घटायो, जबकि DMSO-उपचार गरिएका कोषहरूमा घनत्व १.६९ ± ०.५१% थियो (चित्र २)। ७b)। यी नतिजाहरू प्रोपाइजामाइडको प्रभावसँग विपरित छन्, जसले एक्टिन फिलामेन्टहरूलाई असर गर्दैन, र ल्याट्रुनकुलिन B, एक्टिन डिपोलिमराइजर जसले माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई असर गर्दैन (SI चित्र S6)। यसको अतिरिक्त, coumamonamide 1, coumamonamide एसिड 6, वा KAND 11 को उपचारले HeLa कोषहरूमा माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई असर गरेन (SI चित्र S7)। यसरी, KAND 11 को कार्य संयन्त्र ज्ञात साइटोस्केलेटन अवरोधकहरू भन्दा फरक मानिन्छ। यसको अतिरिक्त, KAND 11 सँग उपचार गरिएको BY-2 कोषहरूको हाम्रो सूक्ष्म अवलोकनले KAND 11 उपचारको क्रममा कोष मृत्युको सुरुवात प्रकट गर्‍यो र देखायो कि KAND 11 उपचारको 30 मिनेट पछि इभान्स नीलो-दाग भएका मृत कोषहरूको अनुपात उल्लेखनीय रूपमा बढेन, जबकि 50 μM वा 100 μM KAND सँग उपचारको 90 मिनेट पछि, मृत कोषहरूको संख्या क्रमशः 43.7% वा 80.1% मा बढ्यो (चित्र 7c)। सँगै लिँदा, यी तथ्याङ्कहरूले संकेत गर्दछ कि उपन्यास ursolic एसिड व्युत्पन्न KAND 11 एक बिरुवा-विशिष्ट साइटोस्केलेटल अवरोधक हो जसको कार्यको पहिले अज्ञात संयन्त्र छ।
KAND ले कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरू, एक्टिन फिलामेन्टहरू, र सुर्तीजन्य BY-2 कोषहरूको व्यवहार्यतालाई असर गर्छ। (a) TagRFP-TUA6 को उपस्थितिमा BY-2 कोषहरूमा कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरूको दृश्यावलोकन। KAND 11 (50 μM वा 100 μM) वा DMSO सँग उपचार गरिएका BY-2 कोषहरूलाई कन्फोकल माइक्रोस्कोपीद्वारा जाँच गरिएको थियो। कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युल घनत्व 25 स्वतन्त्र कोषहरूको माइक्रोग्राफबाट गणना गरिएको थियो। अक्षरहरूले महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (टुकी HSD परीक्षण, p< ०.०५)। स्केल बार = १० µm। (ख) GFP-ABD2 को उपस्थितिमा दृश्यावलोकन गरिएको BY-2 कोषहरूमा कोर्टिकल एक्टिन फिलामेन्टहरू। KAND 11 (50 μM वा 100 μM) वा DMSO सँग उपचार गरिएका BY-2 कोषहरूलाई कन्फोकल माइक्रोस्कोपीद्वारा जाँच गरिएको थियो। कोर्टिकल एक्टिन फिलामेन्टहरूको घनत्व २५ स्वतन्त्र कोषहरूको माइक्रोग्राफबाट गणना गरिएको थियो। अक्षरहरूले महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (टुकी HSD परीक्षण, p< ०.०५)। स्केल बार = १० µm। (c) इभान्स ब्लू स्टेनिङद्वारा मृत BY-२ कोषहरूको अवलोकन। KAND ११ (५० μM वा १०० μM) वा DMSO सँग उपचार गरिएका BY-२ कोषहरूलाई उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोपीद्वारा जाँच गरिएको थियो। n=३। स्केल बार = १०० µm।
नयाँ प्राकृतिक उत्पादनहरूको खोज र प्रयोगले औषधि र कृषि लगायत मानव जीवनका विभिन्न पक्षहरूमा उल्लेखनीय प्रगति गरेको छ। प्राकृतिक स्रोतहरूबाट उपयोगी यौगिकहरू प्राप्त गर्न ऐतिहासिक अनुसन्धान गरिएको छ। विशेष गरी, एक्टिनोमाइसेटहरू नेमाटोडहरूका लागि एन्टी-प्यारासाइटिक एन्टिबायोटिकको रूपमा उपयोगी मानिन्छ किनभने तिनीहरूको विभिन्न माध्यमिक मेटाबोलाइटहरू जस्तै एभरमेक्टिन, आइभरमेक्टिन र ब्लोमाइसिनको सीसा यौगिक र यसको डेरिभेटिभहरू उत्पादन गर्ने क्षमता हुन्छ, जुन क्यान्सर प्रतिरोधी एजेन्टको रूपमा औषधिको रूपमा प्रयोग गरिन्छ21,22। त्यस्तै गरी, एक्टिनोमाइसेटहरूबाट विभिन्न प्रकारका जडीबुटीनाशक यौगिकहरू पत्ता लगाइएको छ, जसमध्ये केही पहिले नै व्यावसायिक रूपमा प्रयोग भइसकेका छन्1,23। त्यसकारण, इच्छित जैविक गतिविधिहरू भएका प्राकृतिक उत्पादनहरूलाई अलग गर्न एक्टिनोमाइसेट मेटाबोलाइटहरूको विश्लेषणलाई प्रभावकारी रणनीति मानिन्छ। यस अध्ययनमा, हामीले एस. वेरेन्सिसबाट एक नयाँ यौगिक, कौमामोनामाइड पत्ता लगायौं र यसलाई सफलतापूर्वक संश्लेषित गर्यौं। उर्सोनिक एसिड अर्बेनामाइड र यसको डेरिभेटिभहरूको सिंथेटिक मध्यवर्ती हो। यसले विशेषता जरा कर्लिंग गराउन सक्छ, मध्यमदेखि बलियो जडीबुटीनाशक गतिविधि प्रदर्शन गर्न सक्छ, र प्रत्यक्ष वा अप्रत्यक्ष रूपमा बिरुवाको सूक्ष्मनलिकाहरूलाई क्षति पुर्‍याउन सक्छ। यद्यपि, उर्मोटोनिक एसिडको कार्य गर्ने संयन्त्र अवस्थित माइक्रोट्यूब्युल अवरोधकहरूको भन्दा फरक हुन सक्छ, किनकि KAND 11 ले एक्टिन फिलामेन्टहरूलाई पनि बाधा पुर्‍याउँछ र कोशिका मृत्यु निम्त्याउँछ, जसले गर्दा उर्मोटोनिक एसिड र यसका डेरिभेटिभहरूले साइटोस्केलेटल संरचनाहरूको विस्तृत दायरालाई प्रभाव पार्ने नियामक संयन्त्रको सुझाव दिन्छ।
अर्बेनोनिक एसिडको थप विस्तृत विशेषता वर्णनले अर्बेनोनिक एसिडको कार्य संयन्त्रलाई राम्रोसँग बुझ्न मद्दत गर्नेछ। विशेष गरी, अर्को लक्ष्य भनेको अर्बेनोनिक एसिड र यसका डेरिभेटिभहरूले माइक्रोट्यूब्युलहरूमा प्रत्यक्ष रूपमा कार्य गर्छन् र तिनीहरूलाई डिपोलिमराइज गर्छन् कि गर्दैनन्, वा तिनीहरूको कार्यले माइक्रोट्यूब्युल अस्थिरतामा परिणाम दिन्छ कि गर्दैन भनेर निर्धारण गर्न कम माइक्रोट्यूब्युलहरूमा बाँध्नको लागि अर्बेनोनिक एसिडको क्षमताको मूल्याङ्कन गर्नु हो। थप रूपमा, जहाँ माइक्रोट्यूब्युलहरू प्रत्यक्ष लक्ष्य होइनन्, बिरुवा कोषहरूमा अर्बेनोनिक एसिडको कार्यस्थल र आणविक लक्ष्यहरू पहिचान गर्नाले सम्बन्धित यौगिकहरूको गुणहरू र जडीबुटी गतिविधि सुधार गर्ने सम्भावित तरिकाहरू बुझ्न मद्दत गर्नेछ। हाम्रो जैविक सक्रियता परखले अरबिडोप्सिस थालियाना, सुर्ती र लिभरवर्ट जस्ता बिरुवाहरूको वृद्धिमा अर्बेनोनिक एसिडको अद्वितीय साइटोटोक्सिक क्षमता प्रकट गर्‍यो, जबकि न त ई. कोलाई न त हेला कोषहरू प्रभावित भए। यदि खुला कृषि क्षेत्रहरूमा प्रयोगको लागि जडीबुटीको रूपमा विकसित गरिएको छ भने पशु कोषहरूमा थोरै वा कुनै विषाक्तता उर्सोनिक एसिड डेरिभेटिभहरूको फाइदा हो। वास्तवमा, युकेरियोट्समा माइक्रोट्यूब्युलहरू सामान्य संरचनाहरू भएकाले, बोटबिरुवाहरूमा तिनीहरूको चयनात्मक निषेध जडीबुटीहरूको लागि एक प्रमुख आवश्यकता हो। उदाहरणका लागि, प्रोपाइजामाइड, एक माइक्रोट्यूब्युल डिपोलिमराइजिंग एजेन्ट जसले सिधै ट्युबुलिनमा बाँध्छ र पोलिमराइजेशनलाई रोक्छ, जनावरको कोषहरूमा कम विषाक्तताको कारणले जडीबुटीको रूपमा प्रयोग गरिन्छ24। डिसोपाइरामाइडको विपरीत, सम्बन्धित बेन्जामाइडहरूमा फरक लक्ष्य विशिष्टताहरू हुन्छन्। बिरुवाको माइक्रोट्यूब्युलहरूको अतिरिक्त, RH-4032 वा बेन्जोक्सामाइडले क्रमशः जनावरको कोषहरू वा ओमाइसेट्सको माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई पनि रोक्छ, र जालिलामाइड यसको कम फाइटोटोक्सिसिटी25,26,27 को कारणले फङ्गिसाइडको रूपमा प्रयोग गरिन्छ। भर्खरै पत्ता लागेको भालु र यसका डेरिभेटिभहरूले बिरुवाहरू विरुद्ध चयनात्मक साइटोटोक्सिसिटी प्रदर्शन गर्छन्, तर यो ध्यान दिन लायक छ कि थप परिमार्जनहरूले तिनीहरूको लक्ष्य विशिष्टतालाई परिवर्तन गर्न सक्छ, सम्भावित रूपमा रोगजनक फंगी वा ओमाइसेट्सको नियन्त्रणको लागि थप डेरिभेटिभहरू प्रदान गर्दछ।
अर्बेनोनिक एसिड र यसका डेरिभेटिभहरूको अद्वितीय गुणहरू जडीबुटीनाशकको ​​रूपमा विकास गर्न र अनुसन्धान उपकरणको रूपमा प्रयोग गर्न उपयोगी छन्। बिरुवाको कोषको आकार नियन्त्रण गर्न साइटोस्केलेटनको महत्त्व व्यापक रूपमा मान्यता प्राप्त छ। पहिलेका अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि बिरुवाहरूले मोर्फोजेनेसिसलाई उचित रूपमा नियन्त्रण गर्न माइक्रोट्यूब्युल गतिशीलता नियन्त्रण गरेर कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युल संगठनको जटिल संयन्त्रहरू विकसित गरेका छन्। माइक्रोट्यूब्युल गतिविधिको नियमनको लागि जिम्मेवार अणुहरूको ठूलो संख्या पहिचान गरिएको छ, र सम्बन्धित अनुसन्धान अझै पनि जारी छ3,4,28। बिरुवा कोषहरूमा माइक्रोट्यूब्युल गतिशीलताको हाम्रो वर्तमान बुझाइले कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युल संगठनको संयन्त्रहरूलाई पूर्ण रूपमा व्याख्या गर्दैन। उदाहरणका लागि, यद्यपि डिसोपाइरामाइड र ओरिजालिन दुवैले माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई डिपोलिमराइज गर्न सक्छन्, डिसोपाइरामाइडले गम्भीर जरा विकृति निम्त्याउँछ जबकि ओरिजालिनको अपेक्षाकृत हल्का प्रभाव हुन्छ। यसबाहेक, माइक्रोट्यूब्युलहरूलाई स्थिर गर्ने ट्युबुलिनमा उत्परिवर्तनले जरामा डेक्सट्रोरोटेसन पनि निम्त्याउँछ, जबकि प्याक्लिटेक्सेल, जसले माइक्रोट्यूब्युल गतिशीलतालाई पनि स्थिर गर्दछ, गर्दैन। त्यसकारण, उर्सोलिक एसिडको आणविक लक्ष्यहरूको अध्ययन र पहिचानले बिरुवाको कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरूको नियमनमा नयाँ अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्नुपर्छ। त्यस्तै गरी, विकृत वृद्धिलाई बढावा दिन प्रभावकारी रसायनहरू, जस्तै डिसोपाइरामाइड, र कम प्रभावकारी रसायनहरू, जस्तै ओरिजालिन वा कुमामोटोरिक एसिड, को भविष्यको तुलनाले विकृत वृद्धि कसरी हुन्छ भन्ने संकेत प्रदान गर्नेछ।
अर्कोतर्फ, रक्षा-सम्बन्धित साइटोस्केलेटल पुनर्संरचनाहरू उर्सोनिक एसिडको साइटोटोक्सिसिटीलाई व्याख्या गर्ने अर्को सम्भावना हो। रोगजनकको संक्रमण वा बिरुवाको कोषहरूमा एलिसिटरको परिचयले कहिलेकाहीं साइटोस्केलेटनको विनाश र त्यसपछिको कोष मृत्यु निम्त्याउँछ29। उदाहरणका लागि, ओमाइसेट-व्युत्पन्न क्रिप्टोक्सान्थिनले सुर्तीजन्य कोष मृत्यु हुनुभन्दा पहिले माइक्रोट्यूब्युलहरू र एक्टिन फिलामेन्टहरूलाई बाधा पुर्‍याउने रिपोर्ट गरिएको छ, जुन KAND उपचारमा हुने जस्तै हो30,31। उर्सोनिक एसिडद्वारा प्रेरित रक्षा प्रतिक्रियाहरू र सेलुलर प्रतिक्रियाहरू बीचको समानताले हामीलाई परिकल्पना गर्न प्रेरित गर्‍यो कि तिनीहरूले सामान्य सेलुलर प्रक्रियाहरू ट्रिगर गर्छन्, यद्यपि क्रिप्टोक्सान्थिन भन्दा उर्सोनिक एसिडको छिटो र बलियो प्रभाव स्पष्ट छ। यद्यपि, अध्ययनहरूले देखाएको छ कि एक्टिन फिलामेन्टहरूको अवरोधले सहज कोष मृत्युलाई बढावा दिन्छ, जुन सधैं माइक्रोट्यूब्युल अवरोधको साथ हुँदैन29। थप रूपमा, यो हेर्न बाँकी छ कि रोगजनक वा एलिसिटरले विकृत जरा वृद्धि निम्त्याउँछ, जस्तै उर्सोनिक एसिड डेरिभेटिभहरूले गर्छन्। यसरी, रक्षा प्रतिक्रियाहरू र साइटोस्केलेटनलाई जोड्ने आणविक ज्ञान सम्बोधन गर्न एक आकर्षक समस्या हो। उर्सोनिक एसिडसँग सम्बन्धित कम आणविक तौल यौगिकहरूको उपस्थितिको शोषण गरेर, साथै फरक क्षमता भएका डेरिभेटिभहरूको दायरा प्रयोग गरेर, तिनीहरूले अज्ञात सेलुलर संयन्त्रहरूलाई लक्षित गर्ने अवसरहरू प्रदान गर्न सक्छन्।
एकसाथ लिँदा, माइक्रोट्यूब्युल गतिशीलतालाई परिमार्जन गर्ने नयाँ यौगिकहरूको खोज र प्रयोगले बिरुवाको कोष आकार निर्धारणमा अन्तर्निहित जटिल आणविक संयन्त्रहरूलाई सम्बोधन गर्न शक्तिशाली विधिहरू प्रदान गर्नेछ। यस सन्दर्भमा, हालै विकसित यौगिक उर्मोटोनिक एसिड, जसले माइक्रोट्यूब्युल र एक्टिन फिलामेन्टहरूलाई असर गर्छ र कोष मृत्युलाई प्रेरित गर्छ, माइक्रोट्यूब्युल नियन्त्रण र यी अन्य संयन्त्रहरू बीचको सम्बन्धलाई बुझ्ने अवसर प्रदान गर्न सक्छ। यसरी, अर्बेनोनिक एसिड प्रयोग गरेर रासायनिक र जैविक विश्लेषणले हामीलाई बिरुवाको साइटोस्केलेटन नियन्त्रण गर्ने आणविक नियामक संयन्त्रहरू बुझ्न मद्दत गर्नेछ।
S. werraensis MK493-CF1 लाई ५०० एमएलको भ्रमित एर्लेनमेयर फ्लास्कमा खोप लगाउनुहोस् जसमा ११० एमएल बीउ माध्यम हुन्छ जसमा २% (w/v) ग्यालेक्टोज, २% (w/v) एसेन्स पेस्ट, १% (w/v) ब्याक्टो संरचना हुन्छ। -सोयटन (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, इंक), ०.५% (w/v) मकैको अर्क (KOGOSTCH कं, लिमिटेड, जापान), ०.२% (w/v) (NH4)2SO4 र ०.२% CaCO3 डिआयोनाइज्ड पानीमा मिसाइन्छ। (pH ७.४ निर्जंतुकीकरण गर्नु अघि)। बीउ संस्कृतिहरूलाई २७°C मा रोटरी शेकर (१८० आरपीएम) मा २ दिनको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो। ठोस अवस्था किण्वन मार्फत उत्पादन खेती। बीउ कल्चर (७ मिलि) लाई ५०० मिलि K-१ फ्लास्कमा स्थानान्तरण गरियो जसमा ४० ग्राम उत्पादन माध्यम थियो जसमा १५ ग्राम प्रेस गरिएको जौ (MUSO Co., Ltd., जापान) र २५ ग्राम डिआयोनाइज्ड पानी (pH निर्जंतुकीकरण गर्नु अघि समायोजन गरिएको थिएन) समावेश थियो। किण्वन १४ दिनको लागि अँध्यारोमा ३० डिग्री सेल्सियसमा गरिएको थियो। किण्वन सामग्री ४० मिलि/बोतल EtOH को साथ निकालिएको थियो र सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो (१५०० ग्राम, ४ डिग्री सेल्सियस, १० मिनेट)। कल्चर सुपरनेटेन्ट (६० मिलि) १०% MeOH/EtOAc को मिश्रणको साथ निकालिएको थियो। जैविक तहलाई कम दबाबमा वाष्पीकरण गरी अवशेष (५९.५ मिलीग्राम) प्राप्त गरिएको थियो, जुन उल्टो चरण स्तम्भमा ग्रेडियन्ट एल्युसन (०-१० मिनेट: ९०%) सँग HPLC गरिएको थियो (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, ५ μm, ID १० मिमी × लम्बाइ २५० मिमी) H2O/CH3CN, १०-३५ मिनेट: ९०% H2O/CH3CN देखि ७०% H2O/CH3CN (ग्रेडियन्ट), ३५-४५ मिनेट: ९०% H2O/EtOH, ४५-१५५ मिनेट: ९०% H2O/EtOH देखि १००% EtOH (ग्रेडियन्ट (ग्रेडियन्ट), १५५-२०० मिनेट: १००% EtOH) १.५ मिली/मिनेटको प्रवाह दरमा, क्युमामोनामाइड (१, ३६.० मिलीग्राम) लाई सेतो अनाकार पाउडरको रूपमा अलग गरिएको थियो।
कुमामोटोआमाइड(१); १H-NMR (५०० MHz, CDCl३) δ ६.९३ (t, J = २.५ Hz, १H), ६.७६ (dd, J = ४.३, १.८ Hz १H), ६.०५ (t, J = ३.८ Hz, १H)। ), ४.०८ (s, ३H); १३C-NMR (१२५ MHz, CDCl३) δ १६१.१, १२१.०, ११९.९, ११२.२, १०५.०, ६८.३; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ गणना गरिएको मान: १४१.०६५९, मापन गरिएको मान: १४१.०६६३, IR νअधिकतम ३४५१, ३४१४, ३१७३, २९३८, १६०३, १५९३, १५३७ सेमी–१।
कोलम्बियाको बीउ (Col-0) अनुसन्धान प्रयोगको लागि अनुमति लिएर Arabidopsis जैविक स्रोत केन्द्र (ABRC) बाट प्राप्त गरिएको थियो। Col-0 बीउहरू हाम्रो प्रयोगशालाको अवस्थामा प्रचार र मर्मत गरिएको थियो र जंगली प्रकारको Arabidopsis बिरुवाको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। Arabidopsis बीउहरूलाई सतहमा निर्जंतुकीकरण गरिएको थियो र २% सुक्रोज (Fujifilm Wako Pure Chemical), ०.०५% (w/v) २-(४-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) भएको आधा-शक्ति मुराशिगे र स्कूग माध्यममा संवर्धित गरिएको थियो। ) र १.५% अगर (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH ५.७, २३ डिग्री सेल्सियस र निरन्तर प्रकाशमा। phs1-1 उत्परिवर्तीको बीउ T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) द्वारा प्रदान गरिएको थियो।
SR-1 को प्रजातिको बीउ T. Hashimoto (नारा विज्ञान तथा प्रविधि संस्थान) द्वारा प्रदान गरिएको थियो र जंगली प्रकारको सुर्तीजन्य बिरुवाको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। अंकुरणलाई बढावा दिन सुर्तीजन्य बीउलाई सतहमा निर्जंतुकीकरण गरिएको थियो र तीन रातसम्म बाँझ पानीमा भिजाइएको थियो, त्यसपछि २% सुक्रोज, ०.०५% (w/v) MES, र ०.८% जेलन गम (फुजिफिल्म वाको शुद्ध रसायन) मुराशिगे र स्कूग माध्यम) भएको आधा-शक्तिको घोलमा pH ५.७ राखिएको थियो र निरन्तर प्रकाशमा २३°C मा इन्क्युबेट गरिएको थियो।
स्ट्रेन टक-१ टी. कोहची (क्योटो विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान गरिएको थियो र कलेजोको अध्ययनको लागि मानक प्रयोगात्मक एकाइको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। जेम्मालाई निर्जंतुकीकरण गरिएको कल्चर गरिएको बिरुवाहरूबाट प्राप्त गरिएको थियो र त्यसपछि १% सुक्रोज र ०.३% जेलन गम भएको ग्याम्बोर्ग B5 माध्यम (फुजिफिल्म वाको शुद्ध रसायन) मा प्लेट गरिएको थियो र निरन्तर प्रकाशमा २३ डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेट गरिएको थियो।
टोब्याक BY-2 कोषहरू (निकोटियाना ट्याबाकम L. cv. ब्राइट येलो २) एस. हसेजावा (टोकियो विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान गरिएको थियो। BY-2 कोषहरूलाई परिमार्जित लिन्समेयर र स्कूग माध्यममा ९५ गुणा पातलो पारिएको थियो र साप्ताहिक रूपमा २,४-डाइक्लोरोफेनोक्सियासेटिक एसिड ३२ ले पूरक गरिएको थियो। कोष निलम्बनलाई अँध्यारोमा २७°C मा १३० rpm मा रोटरी शेकरमा मिसाइएको थियो। ताजा माध्यमको १० गुणा आयतनले कोषहरू धुनुहोस् र उही माध्यममा पुन: निलम्बन गर्नुहोस्। BY-2 ट्रान्सजेनिक कोष रेखाहरू स्थिर रूपमा माइक्रोट्यूब्युल मार्कर TagRFP-TUA6 वा फूलगोभी मोज़ेक भाइरस ३५S प्रमोटर अन्तर्गत एक्टिन फिलामेन्ट मार्कर GFP-ABD2 व्यक्त गर्ने वर्णन गरिए अनुसार उत्पन्न गरिएको थियो। यी कोष रेखाहरूलाई मूल BY-2 कोष रेखाको लागि प्रयोग गरिएका जस्तै प्रक्रियाहरू प्रयोग गरेर कायम राख्न र सिंक्रोनाइज गर्न सकिन्छ।
हेला कोषहरूलाई डुल्बेकोको परिमार्जित ईगलको माध्यम (DMEM) (लाइफ टेक्नोलोजीज) मा १०% भ्रूण गोवाइन सीरम, १.२ U/ml पेनिसिलिन, र १.२ μg/ml स्ट्रेप्टोमाइसिनको साथ पूरक गरी ३७°C मा ५% CO2 भएको इन्क्यूबेटरमा कल्चर गरिएको थियो।
यस पाण्डुलिपिमा वर्णन गरिएका सबै प्रयोगहरू जापानी जैविक सुरक्षा नियमहरू र दिशानिर्देशहरू अनुसार गरिएका थिए।
यौगिकहरूलाई स्टक घोलको रूपमा डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO; फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल) मा घुलाइएको थियो र अरबिडोप्सिस र सुर्तीजन्य पदार्थको लागि MS माध्यममा वा लिभरवर्टको लागि ग्याम्बोर्ग B5 माध्यममा पातलो पारिएको थियो। जराको वृद्धि अवरोध परीक्षणको लागि, प्रति प्लेट १० भन्दा बढी बीउहरू संकेत गरिएका यौगिकहरू वा DMSO भएको अगर माध्यममा रोपिएको थियो। बीउहरूलाई ७ दिनको लागि वृद्धि कक्षमा इन्क्युबेट गरिएको थियो। बिरुवाहरूको फोटो खिचिएको थियो र जराको लम्बाइ मापन गरिएको थियो। अरबिडोप्सिस अंकुरण परीक्षणको लागि, प्रति प्लेट ४८ बीउहरू २०० μM यौगिक वा DMSO भएको अगर माध्यममा रोपिएको थियो। अरबिडोप्सिस बीउहरू वृद्धि कक्षमा उब्जाइएको थियो र अंकुरण भएको बिरुवाहरूको संख्या अंकुरण (डेग) पछि ७ दिनमा गणना गरिएको थियो। सुर्तीजन्य पदार्थको अंकुरण परीक्षणको लागि, प्रति प्लेट २४ बीउहरू २०० μM KAND वा DMSO भएको अगर माध्यममा रोपिएको थियो। सुर्तीजन्य पदार्थको बीउहरू वृद्धि कक्षमा उब्जाइएको थियो र अंकुरण भएको बिरुवाहरूको संख्या १४ दिन पछि गणना गरिएको थियो। लिभरवर्ट वृद्धि अवरोध परीक्षणको लागि, प्रत्येक प्लेटबाट ९ वटा भ्रूणहरूलाई KAND वा DMSO को संकेत गरिएको सांद्रता भएको अगर माध्यममा प्लेट गरिएको थियो र १४ दिनको लागि वृद्धि कक्षमा इन्क्युबेट गरिएको थियो।
जरा मेरिस्टेम संगठन कल्पना गर्न ५ मिलीग्राम/मिली प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) ले रंगिएको बिरुवा प्रयोग गर्नुहोस्। TCS SPE कन्फोकल लेजर स्क्यानिङ माइक्रोस्कोप (Leica Microsystems) प्रयोग गरेर फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोपीद्वारा PI संकेतहरू अवलोकन गरियो।
मलामी र बेन्फेय द्वारा वर्णन गरिएको प्रोटोकल अनुसार β-ग्लुकुरोनिडेज (GUS) को साथ जराको हिस्टोकेमिकल दाग लगाइएको थियो। बिरुवाहरूलाई रातभरि ९०% एसीटोनमा फिक्स गरिएको थियो, १ घण्टाको लागि GUS बफरमा ०.५ मिलीग्राम/मिली ५-ब्रोमो-४-क्लोरो-३-इन्डोलिल-β-डी-ग्लुकुरोनिक एसिडले दाग लगाइएको थियो र हाइड्रेटेड क्लोराल्डिहाइड घोलमा राखिएको थियो। (८ ग्राम क्लोराल हाइड्रेट, २ मिलीलीटर पानी र १ मिलीलीटर ग्लिसरोल) र एक्सियो इमेजर M1 माइक्रोस्कोप (कार्ल जेइस) प्रयोग गरेर विभेदक हस्तक्षेप कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपीद्वारा अवलोकन गरिएको थियो।
ठाडो राखिएका प्लेटहरूमा उमारिएका ७ दिन पुरानो बिरुवाहरूमा जराको कोण मापन गरिएको थियो। चरण ६ मा वर्णन गरिए अनुसार गुरुत्वाकर्षण भेक्टरको दिशाबाट जराको कोण मापन गर्नुहोस्।
प्रोटोकल ३७ मा थोरै परिमार्जनहरू सहित, वर्णन गरिए अनुसार कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरूको व्यवस्था अवलोकन गरियो। एन्टी-β-ट्युबुलिन एन्टिबडी (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) र एलेक्सा फ्लोर ४८८-कन्जुगेटेड एन्टी-माउस IgG (थर्मो फिशर साइन्टिफिक: A32723) क्रमशः १:१००० र १:१०० डिल्युसनमा प्राथमिक र माध्यमिक एन्टिबडीको रूपमा प्रयोग गरियो। TCS SPE कन्फोकल लेजर स्क्यानिङ माइक्रोस्कोप (Leica Microsystems) प्रयोग गरेर फ्लोरोसेन्स छविहरू प्राप्त गरियो। Z-स्ट्याक छविहरू प्राप्त गर्नुहोस् र निर्माताको निर्देशन अनुसार अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपणहरू सिर्जना गर्नुहोस्।
निर्माताको निर्देशन अनुसार सेल काउन्टिङ किट ८ (डोजिन्डो) प्रयोग गरेर HeLa कोष प्रसारण परीक्षण गरिएको थियो।
६०० एनएम (OD600) मा स्पेक्ट्रोफोटोमिटर प्रयोग गरेर कल्चरमा कोशिका घनत्व मापन गरेर ई. कोलाई DH5α को वृद्धिको विश्लेषण गरिएको थियो।
CSU-X1 कन्फोकल स्क्यानिङ उपकरण (योकोगावा) र sCMOS क्यामेरा (जाइला, एन्डोर टेक्नोलोजी) ले सुसज्जित फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोप प्रयोग गरेर ट्रान्सजेनिक BY-2 कोषहरूमा साइटोस्केलेटल संगठन अवलोकन गरिएको थियो। साइटोस्केलेटल घनत्व छवि विश्लेषणद्वारा मूल्याङ्कन गरिएको थियो, जसले वर्णन गरिए अनुसार ImageJ सफ्टवेयर प्रयोग गरेर कन्फोकल छविहरूमा साइटोप्लाज्मिक पिक्सेलहरू बीच साइटोस्केलेटल पिक्सेलको प्रतिशत परिमाण गर्दछ।
BY-2 कोषहरूमा कोष मृत्यु पत्ता लगाउन, कोष निलम्बनको एक अंशलाई कोठाको तापक्रममा १० मिनेटको लागि ०.०५% इभान्स नीलोसँग इन्क्युबेट गरिएको थियो। मृत कोषहरूको चयनात्मक इभान्स नीलो दाग अक्षुण्ण प्लाज्मा झिल्लीद्वारा व्यवहार्य कोषहरूबाट रङको निकासीमा निर्भर गर्दछ। दाग भएका कोषहरूलाई उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोप (BX53, ओलम्पस) प्रयोग गरेर अवलोकन गरिएको थियो।
HeLa कोषहरूलाई DMEM मा १०% FBS को साथ पूरक गरी ३७°C मा आर्द्रता प्राप्त इन्क्यूबेटरमा र ५% CO2 मा हुर्काइएको थियो। कोषहरूलाई १०० μM KAND ११, कुमामोनामिक एसिड ६, कुमामोनामाइड १, १०० ng/ml कोल्सेमिड (गिब्को), वा १०० ng/ml नोकोडमेज (सिग्मा) ले ३७°C मा ६ घण्टाको लागि उपचार गरिएको थियो। कोषहरूलाई १० मिनेटको लागि MetOH र त्यसपछि कोठाको तापक्रममा ५ मिनेटको लागि एसीटेटले फिक्स गरिएको थियो। फिक्स्ड कोषहरूलाई β-ट्युबुलिन प्राथमिक एन्टिबडी (१D४A४, प्रोटिनटेक: ६६२४०-१) ले ०.५% BSA/PBS मा २ घण्टाको लागि पातलो पारिएको थियो, TBST ले ३ पटक धोइएको थियो, र त्यसपछि Alexa Fluor बाख्रा एन्टिबडीले इन्क्युबेट गरिएको थियो। ४८८ १ घण्टा। – माउस IgG (थर्मो फिशर साइन्टिफिक: A11001) र 15 ng/ml 4′,6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (DAPI) 0.5% BSA/PBS मा पातलो। TBST ले तीन पटक धोएपछि, Nikon Eclipse Ti-E उल्टो माइक्रोस्कोपमा दाग लागेको कोषहरू अवलोकन गरियो। मेटामोर्फ सफ्टवेयर (आणविक उपकरणहरू) प्रयोग गरेर चिसो गरिएको Hamamatsu ORCA-R2 CCD क्यामेराको साथ छविहरू खिचिएका थिए।