पाइनको नेमाटोड रोगको प्रेरकको रूपमा आयोडिन र एभरमेक्टिनको मूल्याङ्कन

पाइन नेमाटोड एक क्वारेन्टाइन माइग्रेटरी एन्डोपरासाइट हो जसले पाइन वन इकोसिस्टममा गम्भीर आर्थिक नोक्सान पुर्‍याउँछ भनेर चिनिन्छ। यस अध्ययनले पाइन नेमाटोडहरू विरुद्ध हेलोजेनेटेड इन्डोलहरूको नेमाटिडल गतिविधि र तिनीहरूको कार्य संयन्त्रको समीक्षा गर्दछ। पाइन नेमाटोडहरू विरुद्ध 5-आयोडोइन्डोल र एभरमेक्टिन (सकारात्मक नियन्त्रण) को नेमाटिडल गतिविधिहरू कम सांद्रता (10 μg/mL) मा समान र उच्च थिए। 5-आयोडोइन्डोलले उर्वरता, प्रजनन गतिविधि, भ्रूण र लार्भा मृत्युदर, र लोकोमोटर व्यवहार घटायो। इन्भर्टेब्रेट-विशिष्ट ग्लुटामेट-गेटेड क्लोराइड च्यानल रिसेप्टरहरूसँग लिगान्डहरूको आणविक अन्तरक्रियाले यो धारणालाई समर्थन गर्दछ कि 5-आयोडोइन्डोल, एभरमेक्टिन जस्तै, रिसेप्टर सक्रिय साइटमा कडा रूपमा बाँधिन्छ। 5-आयोडोइन्डोलले नेमाटोडहरूमा विभिन्न फेनोटाइपिक विकृतिहरूलाई पनि प्रेरित गर्‍यो, जसमा असामान्य अंग पतन/संकोचन र बढेको भ्याकुलाइजेसन समावेश छ। यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छ कि भ्याकुओलहरूले नेमाटोड मेथिलेसन-मध्यस्थ मृत्युमा भूमिका खेल्न सक्छन्। महत्त्वपूर्ण कुरा के छ भने, ५-आयोडाइन्डोल दुवै बिरुवा प्रजातिहरू (बन्दागोभी र मुला) को लागि गैर-विषाक्त थियो। यसरी, यस अध्ययनले वातावरणीय परिस्थितिहरूमा आयोडोइन्डोलको प्रयोगले पाइन विल्टको चोटलाई नियन्त्रण गर्न सक्छ भन्ने देखाउँछ।
पाइन वुड नेमाटोड (बर्साफेलेन्चस जाइलोफिलस) पाइन वुड नेमाटोड (PWN) अन्तर्गत पर्दछ, माइग्रेटरी एन्डोपरजीवी नेमाटोडहरू जसले पाइन वन पारिस्थितिक प्रणालीलाई गम्भीर पारिस्थितिक क्षति पुर्‍याउँछ भनेर चिनिन्छ। पाइन वुड नेमाटोडबाट हुने पाइन विल्ट रोग (PWD) एसिया र युरोप सहित धेरै महादेशहरूमा गम्भीर समस्या बन्दै गइरहेको छ, र उत्तरी अमेरिकामा, नेमाटोडले परिचय गरिएका पाइन प्रजातिहरूलाई नष्ट गर्दछ। पाइन रूखको गिरावट एक प्रमुख आर्थिक समस्या हो, र यसको विश्वव्यापी फैलावटको सम्भावना चिन्ताजनक छ। निम्न पाइन प्रजातिहरू प्रायः नेमाटोडद्वारा आक्रमण गरिन्छ: पिनस डेन्सिफ्लोरा, पिनस सिल्भेस्ट्रिस, पिनस थुनबर्गी, पिनस कोराइन्सिस, पिनस थुनबर्गी, पिनस थुनबर्गी, र पिनस रेडियाटा४। पाइन नेमाटोड एक गम्भीर रोग हो जसले संक्रमणको हप्ता वा महिना भित्र पाइन रूखहरूलाई मार्न सक्छ। थप रूपमा, विभिन्न पारिस्थितिक प्रणालीहरूमा पाइन नेमाटोडको प्रकोप सामान्य छ, त्यसैले निरन्तर संक्रमण श्रृंखलाहरू स्थापित भएका छन्।
Bursaphelenchus xylophilus एक क्वारेन्टाइन बिरुवा-परजीवी नेमाटोड हो जुन सुपरफैमिली Aphelenchoidea र clade 102.5 मा पर्दछ। नेमाटोडले फङ्गा खान्छ र पाइन रूखहरूको काठको तन्तुहरूमा पुनरुत्पादन गर्छ, चार फरक लार्भा चरणहरूमा विकास हुन्छ: L1, L2, L3, L4 र एक वयस्क व्यक्ति1,6। खानाको अभावको अवस्थामा, पाइन नेमाटोड एक विशेष लार्भा चरण - डौरमा जान्छ, जसले यसको भेक्टर - पाइन बार्क बीटल (मोनोचामस अल्टरनेटस) लाई परजीवी बनाउँछ र स्वस्थ पाइन रूखहरूमा स्थानान्तरण हुन्छ। स्वस्थ होस्टहरूमा, नेमाटोडहरू चाँडै बिरुवाको तन्तुहरू मार्फत सर्छन् र प्यारेन्काइमाटस कोशिकाहरूमा खुवाउँछन्, जसले संक्रमण पछि एक वर्ष भित्र धेरै अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाहरू, पाइन ओइलाउने र मृत्यु निम्त्याउँछ1,7,8।
पाइन नेमाटोडहरूको जैविक नियन्त्रण लामो समयदेखि चुनौतीपूर्ण रहेको छ, २० औं शताब्दीदेखि नै क्वारेन्टाइन उपायहरू लागू गरिएको छ। पाइन नेमाटोडहरू नियन्त्रण गर्ने हालका रणनीतिहरूमा मुख्यतया रासायनिक उपचारहरू समावेश छन्, जसमा काठको धुवाँ र रूखका हाँगाहरूमा नेमाटिडहरूको प्रत्यारोपण समावेश छ। सबैभन्दा बढी प्रयोग हुने नेमाटिडहरू एभरमेक्टिन र एभरमेक्टिन बेन्जोएट हुन्, जुन एभरमेक्टिन परिवारसँग सम्बन्धित छन्। यी महँगा रसायनहरू धेरै नेमाटोड प्रजातिहरू विरुद्ध अत्यधिक प्रभावकारी छन् र वातावरणीय रूपमा सुरक्षित मानिन्छन्। यद्यपि, यी नेमाटिडहरूको बारम्बार प्रयोगले छनोट दबाब सिर्जना गर्ने अपेक्षा गरिएको छ जसले लगभग निश्चित रूपमा प्रतिरोधी पाइन नेमाटोडहरूको उदय निम्त्याउनेछ, जस्तै धेरै कीरा कीराहरू, जस्तै लेप्टिनोटार्सा डेसेमलाइनाटा, प्लुटेला जाइलोस्टेला र नेमाटोड ट्राइकोस्ट्रोङ्गिलस कोलुब्रिफोर्मिस र ओस्टरटागिया सर्कमसिन्टा, जसले बिस्तारै एभरमेक्टिनहरू विरुद्ध प्रतिरोध विकास गरेका छन्। १०,११,१२। त्यसकारण, PVD नियन्त्रण गर्न वैकल्पिक, लागत-प्रभावी र वातावरणमैत्री उपायहरू फेला पार्न प्रतिरोध ढाँचाहरूको नियमित रूपमा अध्ययन र निमाटिकाइडहरूको निरन्तर जाँच गर्न आवश्यक छ। हालैका दशकहरूमा, धेरै लेखकहरूले निमाटोड नियन्त्रण एजेन्टहरू 13,14,15,16 को रूपमा बिरुवाको अर्क, आवश्यक तेल र वाष्पशील पदार्थहरूको प्रयोग प्रस्ताव गरेका छन्।
हामीले हालै Caenorhabditis elegans 17 मा इन्डोलको नेमाटिसाइडल गतिविधि प्रदर्शन गर्यौं, जुन एक अन्तरकोशिकीय र अन्तरराज्य संकेत अणु हो। इन्डोल माइक्रोबियल पारिस्थितिकीमा एक व्यापक अन्तर्कोशिकीय संकेत हो, जसले माइक्रोबियल फिजियोलोजी, बीजाणु गठन, प्लाज्मिड स्थिरता, औषधि प्रतिरोध, बायोफिल्म गठन, र विषाणु 18, 19 लाई असर गर्ने असंख्य कार्यहरू नियन्त्रण गर्दछ। अन्य रोगजनक नेमाटोडहरू विरुद्ध इन्डोल र यसको डेरिभेटिभहरूको गतिविधि अध्ययन गरिएको छैन। यस अध्ययनमा, हामीले पाइन नेमाटोडहरू विरुद्ध 34 इन्डोलहरूको नेमाटिसाइडल गतिविधिको अनुसन्धान गर्यौं र माइक्रोस्कोपी, टाइम-ल्याप्स फोटोग्राफी, र आणविक डकिङ प्रयोगहरू प्रयोग गरेर सबैभन्दा शक्तिशाली 5-आयोडोइन्डोलको कार्य संयन्त्र स्पष्ट पार्यौं, र बीज अंकुरण परख प्रयोग गरेर बिरुवाहरूमा यसको विषाक्त प्रभावहरूको मूल्याङ्कन गर्यौं।
इन्डोलको उच्च सांद्रता (>१.० मिमी) ले पहिले नै नेमाटोडहरूमा नेमाटिसाइडल प्रभाव पारेको रिपोर्ट गरिएको छ। बी. जाइलोफिलस (मिश्रित जीवन चरणहरू) लाई १ मिमीमा इन्डोल वा ३३ फरक इन्डोल डेरिभेटिभहरूसँग उपचार गरेपछि, नियन्त्रण र उपचार गरिएका समूहहरूमा जीवित र मृत नेमाटोडहरू गणना गरेर बी. जाइलोफिलसको मृत्युदर मापन गरिएको थियो। पाँच इन्डोलहरूले महत्त्वपूर्ण नेमाटिसाइडल गतिविधि प्रदर्शन गरे; उपचार नगरिएको नियन्त्रण समूहको बाँच्ने दर २४ घण्टा पछि ९५ ± ७% थियो। परीक्षण गरिएका ३४ इन्डोलहरू मध्ये, १ मिमीमा ५-आयोडोइन्डोल र ४-फ्लोरोइन्डोलले १००% मृत्युदर निम्त्यायो, जबकि ५,६-डाइफ्लुरोइन्डिगो, मिथाइलइन्डोल-७-कार्बोक्सिलेट, र ७-आयोडोइन्डोलले लगभग ५०% मृत्युदर निम्त्यायो (तालिका १)।
पाइन वुड नेमाटोडको भ्याकुओल गठन र मेटाबोलिज्ममा ५-आयोडोइन्डोलको प्रभाव। (A) वयस्क नर नेमाटोडहरूमा एभरमेक्टिन र ५-आयोडोइन्डोलको प्रभाव, (B) L1 चरणको नेमाटोड अण्डा र (C) B. जाइलोफिलसको चयापचय, (i) ० घण्टामा भ्याकुओलहरू अवलोकन गरिएन, उपचारको परिणामस्वरूप (ii) भ्याकुओलहरू, (iii) धेरै भ्याकुओलहरूको संचय, (iv) भ्याकुओलहरूको सुन्निने, (v) भ्याकुओलहरूको फ्यूजन र (vi) विशाल भ्याकुओलहरूको गठन भयो। रातो तीरहरूले भ्याकुओलहरूको सुन्निने संकेत गर्दछ, नीलो तीरहरूले भ्याकुओलहरूको फ्यूजन र कालो तीरहरूले विशाल भ्याकुओलहरू संकेत गर्दछ। स्केल बार = ५० μm।
यसका साथै, यस अध्ययनले पाइन नेमाटोडहरूमा मिथेन-प्रेरित मृत्युको क्रमिक प्रक्रियाको पनि वर्णन गरेको छ (चित्र ४C)। मेथेनोजेनिक मृत्यु प्रमुख साइटोप्लाज्मिक भ्याकुओल्सको संचयसँग सम्बन्धित गैर-एपोप्टोटिक प्रकारको कोशिका मृत्यु हो। पाइन नेमाटोडहरूमा देखिएका रूपात्मक दोषहरू मिथेन-प्रेरित मृत्युको संयन्त्रसँग नजिकबाट सम्बन्धित देखिन्छन्। विभिन्न समयमा गरिएको सूक्ष्म परीक्षणले देखाएको छ कि ५-आयोडोइन्डोल (०.१ मिमी) को सम्पर्कमा आएको २० घण्टा पछि विशाल भ्याकुओल्स बनेका थिए। उपचारको ८ घण्टा पछि सूक्ष्म भ्याकुओल्स अवलोकन गरिएको थियो, र १२ घण्टा पछि तिनीहरूको संख्या बढेको थियो। १४ घण्टा पछि धेरै ठूला भ्याकुओल्स अवलोकन गरिएको थियो। उपचारको १२-१६ घण्टा पछि धेरै फ्युज्ड भ्याकुओल्स स्पष्ट रूपमा देखिन्थे, जसले भ्याकुओल फ्युजन मेथेनोजेनिक मृत्यु संयन्त्रको आधार हो भनेर संकेत गर्दछ। २० घण्टा पछि, गँड्यौलाभरि धेरै विशाल भ्याकुओल्स फेला परे। यी अवलोकनहरूले सी. एलिगन्समा मेटुओसिसको पहिलो रिपोर्टलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।
५-आयोडिनडोल-उपचार गरिएको किराहरूमा, भ्याकुओल एकत्रीकरण र फुट्ने पनि अवलोकन गरिएको थियो (चित्र ५), जुन किरा झुक्ने र वातावरणमा भ्याकुओल रिलिजबाट प्रमाणित हुन्छ। अण्डाको खोलको झिल्लीमा भ्याकुओल अवरोध पनि अवलोकन गरिएको थियो, जुन सामान्यतया ह्याचिङको समयमा L2 द्वारा अक्षुण्ण रूपमा संरक्षित हुन्छ (पूरक चित्र S2)। यी अवलोकनहरूले भ्याकुओल गठन र सपोरेशनको प्रक्रियामा तरल पदार्थ संचय र ओस्मोरेगुलेटरी विफलता, साथै उल्टाउन सकिने कोशिका चोट (RCI) को संलग्नतालाई समर्थन गर्दछ (चित्र ५)।
अवलोकन गरिएको भ्याकुओल गठनमा आयोडिनको भूमिकाको परिकल्पना गर्दै, हामीले सोडियम आयोडाइड (NaI) र पोटासियम आयोडाइड (KI) को नेमाटिसाइडल गतिविधिको अनुसन्धान गर्यौं। यद्यपि, सांद्रता (०.१, ०.५ वा १ मिमी) मा, तिनीहरूले नेमाटोडको अस्तित्व वा भ्याकुओल गठनलाई असर गरेनन् (पूरक चित्र S5), यद्यपि १ मिमी KI मा थोरै नेमाटिसाइडल प्रभाव थियो। अर्कोतर्फ, ७-आयोडोइन्डोल (१ वा २ मिमी), जस्तै ५-आयोडोइन्डोलले, धेरै भ्याकुओलहरू र संरचनात्मक विकृतिहरू प्रेरित गर्‍यो (पूरक चित्र S6)। दुई आयोडोइन्डोलहरूले पाइन नेमाटोडहरूमा समान फेनोटाइपिक विशेषताहरू देखाए, जबकि NaI र KI ले देखाएनन्। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, इन्डोलले परीक्षण गरिएको सांद्रतामा B. जाइलोफिलसमा भ्याकुओल गठनलाई प्रेरित गरेन (डेटा देखाइएको छैन)। यसरी, परिणामहरूले पुष्टि गर्‍यो कि इन्डोल-आयोडिन कम्प्लेक्स B. जाइलोफिलसको भ्याकुओलाइजेसन र मेटाबोलिज्मको लागि जिम्मेवार छ।
नेमाटिसाइडल गतिविधिको लागि परीक्षण गरिएका इन्डोलहरू मध्ये, 5-आयोडोइन्डोलको उच्चतम स्लिप इन्डेक्स -5.89 kcal/mol थियो, त्यसपछि 7-आयोडोइन्डोल (-4.48 kcal/mol), 4-फ्लोरोइन्डोल (-4.33), र इन्डोल (-4.03) (चित्र 6) थियो। 5-आयोडोइन्डोलको ल्युसिन 218 सँगको बलियो ब्याकबोन हाइड्रोजन बन्धनले यसको बन्धनलाई स्थिर बनाउँछ, जबकि अन्य सबै इन्डोल डेरिभेटिभहरूले साइड चेन हाइड्रोजन बन्धनहरू मार्फत सेरिन 260 मा बाँध्छन्। अन्य मोडेल गरिएका आयोडोइन्डोलहरू मध्ये, २-आयोडोइन्डोलको बाइन्डिङ मान -५.२४८ kcal/mol छ, जुन यसको मुख्य हाइड्रोजन बन्धनको कारणले हो ल्युसिन २१८। अन्य ज्ञात बाइन्डिङहरूमा ३-आयोडोइन्डोल (-४.३ kcal/mol), ४-आयोडोइन्डोल (-४.० kcal/mol), र ६-फ्लोरोइन्डोल (-२.६ kcal/mol) (पूरक चित्र S8) समावेश छन्। ५-आयोडोइन्डोल र २-आयोडोइन्डोल बाहेक धेरैजसो हेलोजेनेटेड इन्डोल र इन्डोल आफैंले सेरिन २६० सँग बन्धन बनाउँछन्। आइभरमेक्टिन (पूरक चित्र S7) को लागि अवलोकन गरिएझैं ल्युसिन २१८ सँग हाइड्रोजन बन्धन कुशल रिसेप्टर-लिगान्ड बन्धनको सूचक हो भन्ने तथ्यले पुष्टि गर्छ कि आइभरमेक्टिन जस्तै ५-आयोडोइन्डोल र २-आयोडोइन्डोल पनि ल्युसिन २१८ मार्फत ग्लुसीएल रिसेप्टरको सक्रिय साइटमा कडा रूपमा बाँधिन्छन् (चित्र ६ र पूरक चित्र S8)। हामी प्रस्ताव गर्छौं कि यो बन्धन ग्लुसीएल कम्प्लेक्सको खुला छिद्र संरचना कायम राख्न आवश्यक छ र ग्लुसीएल रिसेप्टरको सक्रिय साइटमा कडा रूपमा बाँधेर, ५-आयोडोइन्डोल, २-आयोडोइन्डोल, एभरमेक्टिन र आइभरमेक्टिनले यसरी आयन च्यानललाई खुला राख्छन् र तरल पदार्थको अवशोषणलाई अनुमति दिन्छन्।
इन्डोल र हेलोजेनेटेड इन्डोलको GluCL मा आणविक डकिङ। (A) इन्डोल, (B) 4-फ्लोरोइन्डोल, (C) 7-आयोडोइन्डोल, र (D) 5-आयोडोइन्डोल लिगान्डहरूको GluCL को सक्रिय साइटमा बाँध्ने अभिमुखीकरण। प्रोटिनलाई रिबनद्वारा प्रतिनिधित्व गरिन्छ, र ब्याकबोन हाइड्रोजन बन्धनहरूलाई पहेंलो थोप्ला भएका रेखाहरूको रूपमा देखाइन्छ। (A′), (B′), (C′), र (D′) ले वरपरका एमिनो एसिड अवशेषहरूसँग सम्बन्धित लिगान्डहरूको अन्तरक्रिया देखाउँछन्, र साइड-चेन हाइड्रोजन बन्धनहरूलाई गुलाबी थोप्ला भएका तीरहरूद्वारा संकेत गरिन्छ।
बन्दा र मूलाको बीउको अंकुरणमा ५-आयोडोइन्डोलको विषाक्त प्रभावको मूल्याङ्कन गर्न प्रयोगहरू गरिएको थियो। ५-आयोडोइन्डोल (०.०५ वा ०.१ मिमी) वा एभरमेक्टिन (१० μg/मिली) ले प्रारम्भिक अंकुरण र बिरुवाको उदयमा थोरै वा कुनै प्रभाव पारेन (चित्र ७)। यसको अतिरिक्त, उपचार नगरिएको नियन्त्रण र ५-आयोडोइन्डोल वा एभरमेक्टिनले उपचार गरिएको बीउको अंकुरण दर बीच कुनै महत्त्वपूर्ण भिन्नता फेला परेन। जराको लम्बाइ र बनेको पार्श्व जराको संख्यामा प्रभाव नगण्य थियो, यद्यपि ५-आयोडोइन्डोलको १ मिमी (यसको सक्रिय सांद्रताको १० गुणा) ले पार्श्व जराको विकासमा थोरै ढिलाइ गर्‍यो। यी नतिजाहरूले ५-आयोडोइन्डोल बिरुवाको कोषहरूको लागि गैर-विषाक्त छ र अध्ययन गरिएको सांद्रतामा बिरुवा विकास प्रक्रियाहरूमा हस्तक्षेप गर्दैन भनेर संकेत गर्दछ।
बीउ अंकुरणमा ५-आयोडोइन्डोलको प्रभाव। एभरमेक्टिन वा ५-आयोडोइन्डोल सहित वा बिना मुराशिगे र स्कूग अगर माध्यममा बी. ओलेरेसिया र आर. राफानिस्ट्रम बीउको अंकुरण, अंकुरण र पार्श्व जरा। २२ डिग्री सेल्सियसमा ३ दिनको इन्क्युबेशन पछि अंकुरण रेकर्ड गरिएको थियो।
यस अध्ययनले इन्डोलहरूद्वारा नेमाटोड मार्ने धेरै घटनाहरू रिपोर्ट गर्दछ। महत्त्वपूर्ण कुरा, यो पाइन सुईहरूमा आयोडोइन्डोलले मिथाइलेशन (साना भ्याकुओलहरूको संचयबाट हुने प्रक्रिया जुन बिस्तारै विशाल भ्याकुओलहरूमा मर्ज हुन्छ, अन्ततः झिल्ली फुट्ने र मृत्यु निम्त्याउँछ) प्रेरित गर्ने पहिलो रिपोर्ट हो, जसमा आयोडोइन्डोलले व्यावसायिक नेमाटाइड एभरमेक्टिनको जस्तै महत्त्वपूर्ण नेमाटिडल गुणहरू प्रदर्शन गर्दछ।
इन्डोलहरूले पहिले नै प्रोकारियोट र युकेरियोटहरूमा धेरै संकेतात्मक कार्यहरू गर्ने रिपोर्ट गरिएको छ, जसमा बायोफिल्म निषेध/गठन, ब्याक्टेरियाको अस्तित्व, र रोगजनकता समावेश छ19,32,33,34। हालै, हेलोजेनेटेड इन्डोलहरू, इन्डोल एल्कालोइडहरू, र अर्ध-सिंथेटिक इन्डोल डेरिभेटिभहरूको सम्भावित चिकित्सीय प्रभावहरूले व्यापक अनुसन्धान रुचि आकर्षित गरेको छ35,36,37। उदाहरणका लागि, हेलोजेनेटेड इन्डोलहरूले निरन्तर एस्चेरिचिया कोलाई र स्टेफिलोकोकस ऑरियस कोशिकाहरूलाई मार्ने देखाइएको छ37। थप रूपमा, अन्य प्रजातिहरू, जेनेरा र राज्यहरू विरुद्ध हेलोजेनेटेड इन्डोलहरूको प्रभावकारिता अध्ययन गर्नु वैज्ञानिक चासोको विषय हो, र यो अध्ययन यो लक्ष्य प्राप्त गर्ने दिशामा एक कदम हो।
यहाँ, हामी रिभर्सिबल सेल इन्जुरी (RCI) र मिथाइलेशन (चित्र 4C र 5) मा आधारित C. एलिगेन्समा 5-आयोडोइन्डोल-प्रेरित घातकताको लागि एक संयन्त्र प्रस्ताव गर्छौं। पफिनेस र भ्याकुलर डिजेनेरेशन जस्ता एडिमेटस परिवर्तनहरू RCI र मिथाइलेशनका सूचक हुन्, जुन साइटोप्लाज्ममा विशाल भ्याकुओलहरूको रूपमा प्रकट हुन्छन्48,49। RCI ले ATP उत्पादन घटाएर, ATPase पम्पको विफलता निम्त्याएर, वा कोशिका झिल्लीहरू बाधा पुर्‍याएर र Na+, Ca2+, र पानीको द्रुत प्रवाह निम्त्याएर ऊर्जा उत्पादनमा हस्तक्षेप गर्दछ50,51,52। Ca2+ र पानीको प्रवाहको कारण साइटोप्लाज्ममा तरल पदार्थ जम्मा हुने परिणामस्वरूप जनावरको कोषहरूमा इन्ट्रासाइटोप्लाज्मिक भ्याकुओलहरू उत्पन्न हुन्छन्53। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, यदि क्षति अस्थायी हो र कोषहरूले निश्चित समयको लागि ATP उत्पादन गर्न थाल्छन् भने कोष क्षतिको यो संयन्त्र उल्टाउन सकिन्छ, तर यदि क्षति जारी रह्यो वा बिग्रियो भने, कोषहरू मर्छन्।54 हाम्रो अवलोकनले देखाउँछ कि 5-आयोडोइन्डोलसँग उपचार गरिएका नेमाटोडहरू तनाव अवस्थाको सम्पर्कमा आएपछि सामान्य जैव संश्लेषण पुनर्स्थापित गर्न असमर्थ हुन्छन्।
B. xylophilus मा 5-आयोडोइन्डोल द्वारा प्रेरित मिथाइलेशन फेनोटाइप आयोडिनको उपस्थिति र यसको आणविक वितरणको कारण हुन सक्छ, किनकि 7-आयोडोइन्डोलले B. xylophilus मा 5-आयोडोइन्डोल भन्दा कम निरोधात्मक प्रभाव पारेको थियो (तालिका 1 र पूरक चित्र S6)। यी नतिजाहरू आंशिक रूपमा माल्टीज एट अल. (2014) को अध्ययनसँग मिल्दोजुल्दो छन्, जसले रिपोर्ट गरेका थिए कि इन्डोलमा पाइरिडाइल नाइट्रोजन मोइटीको प्यारा-बाट मेटा-पोजिसनमा स्थानान्तरण रद्द गरिएको भ्याकुओलाइजेसन, वृद्धि अवरोध, र U251 कोशिकाहरूमा साइटोटोक्सिसिटी, जसले सुझाव दिन्छ कि प्रोटीनमा एक विशिष्ट सक्रिय साइटसँग अणुको अन्तरक्रिया महत्वपूर्ण छ27,44,45। यस अध्ययनमा अवलोकन गरिएको इन्डोल वा हेलोजेनेटेड इन्डोलहरू र GluCL रिसेप्टरहरू बीचको अन्तरक्रियाले पनि यो धारणालाई समर्थन गर्दछ, किनकि 5- र 2-आयोडोइन्डोल GluCL रिसेप्टरहरूसँग जाँच गरिएका अन्य इन्डोलहरू भन्दा बढी बलियो रूपमा बाँधिएको पाइयो (चित्र 6 र पूरक चित्र S8)। इन्डोलको दोस्रो वा पाँचौं स्थानमा रहेको आयोडिनले ब्याकबोन हाइड्रोजन बन्धन मार्फत GluCL रिसेप्टरको ल्युसिन २१८ मा बाँधिएको पाइयो, जबकि अन्य हेलोजेनेटेड इन्डोलहरू र इन्डोल आफैंले सेरिन २६० सँग कमजोर साइड-चेन हाइड्रोजन बन्धन बनाउँछन् (चित्र ६)। त्यसकारण हामी अनुमान गर्छौं कि हेलोजनको स्थानीयकरणले भ्याकुओलर डिजेनेरेशनको प्रेरणामा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ, जबकि ५-आयोडोइन्डोलको कडा बन्धनले आयन च्यानललाई खुला राख्छ, जसले गर्दा द्रुत तरल पदार्थ प्रवाह र भ्याकुओल फुट्न अनुमति दिन्छ। यद्यपि, ५-आयोडोइन्डोलको कार्यको विस्तृत संयन्त्र निर्धारण गर्न बाँकी छ।
५-आयोडोइन्डोलको व्यावहारिक प्रयोग गर्नु अघि, बिरुवाहरूमा यसको विषाक्त प्रभावको विश्लेषण गरिनुपर्छ। हाम्रा बीउ अंकुरण प्रयोगहरूले अध्ययन गरिएको सांद्रतामा ५-आयोडोइन्डोलले बीउ अंकुरण वा त्यसपछिको विकास प्रक्रियाहरूमा कुनै नकारात्मक प्रभाव पारेन भनेर देखाएको छ (चित्र ७)। यसरी, यो अध्ययनले पाइन रूखहरूमा पाइन नेमाटोडको हानिकारकता नियन्त्रण गर्न पारिस्थितिक वातावरणमा ५-आयोडोइन्डोलको प्रयोगको लागि आधार प्रदान गर्दछ।
अघिल्ला रिपोर्टहरूले देखाएका छन् कि इन्डोल-आधारित थेरापीले एन्टिबायोटिक प्रतिरोध र क्यान्सर प्रगतिको समस्यालाई सम्बोधन गर्न सम्भावित दृष्टिकोणको प्रतिनिधित्व गर्दछ55। यसको अतिरिक्त, इन्डोलहरूमा जीवाणुरोधी, क्यान्सर प्रतिरोधी, एन्टिअक्सिडेन्ट, एन्टी-इन्फ्लेमेटरी, एन्टीडायबेटिक, एन्टिभाइरल, एन्टिप्रोलिफेरेटिभ र एन्टीट्यूबरकुलोसिस गतिविधिहरू हुन्छन् र औषधि विकासको लागि आशाजनक आधारको रूपमा काम गर्न सक्छन्56,57। यो अध्ययनले पहिलो पटक आयोडिनको सम्भावित प्रयोगलाई एन्टीप्यारासिटिक र एन्थेलमिन्टिक एजेन्टको रूपमा सुझाव दिन्छ।
एभरमेक्टिन तीन दशक अघि पत्ता लागेको थियो र २०१५ मा नोबेल पुरस्कार जितेको थियो, र एन्थेलमिन्टिकको रूपमा यसको प्रयोग अझै पनि सक्रिय रूपमा जारी छ। यद्यपि, नेमाटोड र कीरा कीराहरूमा एभरमेक्टिन प्रतिरोधको द्रुत विकासको कारण, पाइन रूखहरूमा PWN संक्रमण नियन्त्रण गर्न वैकल्पिक, कम लागत, र वातावरणमैत्री रणनीति आवश्यक छ। यस अध्ययनले ५-आयोडोइन्डोलले पाइन नेमाटोडहरूलाई कसरी मार्छ र ५-आयोडोइन्डोलमा बिरुवा कोषहरूमा कम विषाक्तता हुन्छ भन्ने संयन्त्रको पनि रिपोर्ट गर्दछ, जसले यसको भविष्यको व्यावसायिक प्रयोगको लागि राम्रो सम्भावनाहरू खोल्छ।
सबै प्रयोगहरू कोरियाको ग्योङ्सानस्थित येउङ्नाम विश्वविद्यालयको नैतिकता समितिद्वारा अनुमोदन गरिएको थियो र विधिहरू येउङ्नाम विश्वविद्यालयको नैतिकता समितिको दिशानिर्देशन अनुसार गरिएको थियो।
अण्डाको इन्क्युबेशन प्रयोगहरू स्थापित प्रक्रियाहरू प्रयोग गरेर गरिएको थियो43। ह्याचिङ दर (HR) मूल्याङ्कन गर्न, १-दिनका वयस्क नेमाटोडहरू (लगभग १०० पोथी र १०० भाले) लाई फङ्गस भएको पेट्री डिशमा स्थानान्तरण गरियो र २४ घण्टासम्म बढ्न दिइयो। त्यसपछि अण्डाहरूलाई अलग गरियो र बाँझ डिस्टिल्ड पानीमा सस्पेन्सनको रूपमा ५-आयोडोइन्डोल (०.०५ मिमी र ०.१ मिमी) वा एभरमेक्टिन (१० μg/ml) ले उपचार गरियो। यी सस्पेन्सनहरू (५०० μl; लगभग १०० अण्डा) २४-कुवा टिस्यु कल्चर प्लेटको इनारमा स्थानान्तरण गरियो र २२ डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेट गरियो। इन्क्युबेशनको २४ घण्टा पछि L2 गणनाहरू गरिएको थियो तर राम्रो प्लेटिनम तारले उत्तेजित गर्दा कोषहरू नचलेमा मृत मानिन्थ्यो। यो प्रयोग दुई चरणहरूमा गरिएको थियो, प्रत्येकमा छ पटक दोहोरिने। दुवै प्रयोगहरूबाट डेटा संयोजन र प्रस्तुत गरिएको थियो। HR को प्रतिशत निम्नानुसार गणना गरिएको छ:
पहिले विकसित प्रक्रियाहरू प्रयोग गरेर लार्भा मृत्युदरको मूल्याङ्कन गरिएको थियो। नेमाटोड अण्डाहरू सङ्कलन गरिएको थियो र L2 चरणको लार्भा उत्पन्न गर्न बाँझ आसुत पानीमा ह्याचिङ गरेर भ्रूणहरूलाई समक्रमण गरिएको थियो। सिंक्रोनाइज्ड लार्भा (लगभग ५०० नेमाटोडहरू) लाई ५-आयोडोइन्डोल (०.०५ मिमी र ०.१ मिमी) वा एभरमेक्टिन (१० μg/ml) ले उपचार गरिएको थियो र B. सिनेरिया पेट्री प्लेटहरूमा हुर्काइएको थियो। २२ डिग्री सेल्सियसमा ४८ घण्टा इन्क्युबेशन पछि, नेमाटोडहरू बाँझ आसुत पानीमा सङ्कलन गरिएको थियो र L2, L3, र L4 चरणहरूको उपस्थितिको लागि जाँच गरिएको थियो। L3 र L4 चरणहरूको उपस्थितिले लार्भा रूपान्तरणलाई संकेत गर्‍यो, जबकि L2 चरणको उपस्थितिले कुनै रूपान्तरणलाई संकेत गर्‍यो। iRiS™ डिजिटल सेल इमेजिङ प्रणाली प्रयोग गरेर छविहरू प्राप्त गरिएको थियो। यो प्रयोग दुई चरणहरूमा गरिएको थियो, प्रत्येकमा छ पटक दोहोरिने। दुवै प्रयोगहरूबाट डेटा संयोजन र प्रस्तुत गरिएको थियो।
मुराशिगे र स्कूग अगर प्लेटहरूमा अंकुरण परीक्षण प्रयोग गरेर बीउहरूमा ५-आयोडिनडोल र एभरमेक्टिनको विषाक्तता मूल्याङ्कन गरिएको थियो। ६२ बी. ओलेरेसिया र आर. राफानिस्ट्रम बीउहरूलाई पहिले एक दिनको लागि बाँझ आसुत पानीमा भिजाइयो, १ मिलीलीटर १००% इथेनॉलले धोइयो, १ मिलीलीटर ५०% व्यावसायिक ब्लीच (३% सोडियम हाइपोक्लोराइट) ले १५ मिनेटको लागि बाँझ पारियो, र १ मिलीलीटर बाँझ पानीले पाँच पटक धोइयो। त्यसपछि बाँझ पारिएको बीउहरूलाई ०.८६ ग्राम/लिटर (०.२X) मुराशिगे र स्कूग मध्यम र ०.७% ब्याक्टेरियोलोजिकल अगर भएको अंकुरण अगर प्लेटहरूमा थिचियो जसमा ५-आयोडिनडोल वा एभरमेक्टिन वा बिना वा बिना। त्यसपछि प्लेटहरूलाई २२ डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेट गरिएको थियो, र ३ दिनको इन्क्युबेशन पछि छविहरू लिइयो। यो प्रयोग दुई चरणमा गरिएको थियो, जसमध्ये प्रत्येकमा छ पटक दोहोरिएको थियो।