साना जलीय ट्याडपोलहरूमा व्यावसायिक साइपरमेथ्रिन तयारीहरूको मृत्युदर र विषाक्तता

यस अध्ययनले व्यावसायिकको घातकता, सूक्ष्मघातकता र विषाक्तताको मूल्याङ्कन गर्‍योसाइपरमेथ्रिनअनुरन ट्याडपोलहरूमा सूत्रीकरण। तीव्र परीक्षणमा, १००-८०० μg/L को सांद्रता ९६ घण्टाको लागि परीक्षण गरिएको थियो। पुरानो परीक्षणमा, प्राकृतिक रूपमा हुने साइपरमेथ्रिन सांद्रता (१, ३, ६, र २० μg/L) मृत्युदरको लागि परीक्षण गरिएको थियो, त्यसपछि माइक्रोन्यूक्लियस परीक्षण र ७ दिनको लागि रातो रक्त कोशिका आणविक असामान्यताहरू। ट्याडपोलहरूमा व्यावसायिक साइपरमेथ्रिन सूत्रीकरणको LC50 २७३.४१ μg L−१ थियो। पुरानो परीक्षणमा, उच्चतम सांद्रता (२० μg L−१) ले ५०% भन्दा बढी मृत्युदर निम्त्यायो, किनकि यसले परीक्षण गरिएका आधा ट्याडपोलहरूलाई मार्यो। माइक्रोन्यूक्लियस परीक्षणले ६ र २० μg L−१ मा महत्त्वपूर्ण परिणामहरू देखायो र धेरै आणविक असामान्यताहरू पत्ता लगाइयो, जसले व्यावसायिक साइपरमेथ्रिन सूत्रीकरणमा P. gracilis विरुद्ध जीनोटोक्सिक क्षमता रहेको संकेत गर्दछ। साइपरमेथ्रिन यस प्रजातिको लागि उच्च जोखिम हो, जसले यसले धेरै समस्याहरू निम्त्याउन सक्छ र छोटो र लामो अवधिमा यस पारिस्थितिक प्रणालीको गतिशीलतालाई असर गर्न सक्छ भन्ने संकेत गर्दछ। त्यसकारण, यो निष्कर्षमा पुग्न सकिन्छ कि व्यावसायिक साइपरमेथ्रिन सूत्रहरूले पी. ग्रासिलिसमा विषाक्त प्रभाव पार्छ।
कृषि गतिविधिहरूको निरन्तर विस्तार र गहन प्रयोगको कारणले गर्दाकीरा नियन्त्रणउपायहरू, जलचरहरू बारम्बार कीटनाशकहरूको सम्पर्कमा आउँछन् १,२। कृषि क्षेत्र नजिकैको पानी स्रोतहरूको प्रदूषणले उभयचर जस्ता गैर-लक्षित जीवहरूको विकास र अस्तित्वलाई असर गर्न सक्छ।
वातावरणीय म्याट्रिक्सको मूल्याङ्कनमा उभयचरहरू बढ्दो रूपमा महत्त्वपूर्ण हुँदै गइरहेका छन्। जटिल जीवन चक्र, द्रुत लार्भा वृद्धि दर, ट्रोफिक स्थिति, पारगम्य छाला10,11, प्रजननको लागि पानीमा निर्भरता12 र असुरक्षित अण्डा11,13,14 जस्ता अद्वितीय विशेषताहरूका कारण अनुरान्सलाई वातावरणीय प्रदूषकहरूको राम्रो जैविक सूचक मानिन्छ। सानो पानी भ्यागुता (फिसालेमस ग्रासिलिस), जसलाई सामान्यतया रुने भ्यागुता भनेर चिनिन्छ, कीटनाशक प्रदूषण4,5,6,7,15 को जैविक सूचक प्रजातिको रूपमा देखाइएको छ। यो प्रजाति अर्जेन्टिना, उरुग्वे, पाराग्वे र ब्राजिल1617 मा स्थिर पानी, संरक्षित क्षेत्रहरू वा परिवर्तनशील बासस्थान भएका क्षेत्रहरूमा पाइन्छ र यसको व्यापक वितरण र विभिन्न बासस्थान18 को सहनशीलताको कारण IUCN वर्गीकरणद्वारा स्थिर मानिन्छ।
साइपरमेथ्रिनको सम्पर्कमा आएपछि उभयचरहरूमा सूक्ष्मघातक प्रभावहरू रिपोर्ट गरिएको छ, जसमा ट्याडपोलहरूमा व्यवहारिक, रूपात्मक र जैव रासायनिक परिवर्तनहरू २३,२४,२५, मृत्युदर र मेटामोर्फोसिस समय, इन्जाइम्याटिक परिवर्तनहरू, ह्याचिङ सफलतामा कमी २४,२५, हाइपरएक्टिभिटी २६, कोलिनेस्टेरेज गतिविधिको अवरोध २७ र पौडी खेल्ने प्रदर्शनमा परिवर्तनहरू ७,२८ समावेश छन्। यद्यपि, उभयचरहरूमा साइपरमेथ्रिनको जीनोटोक्सिक प्रभावहरूको अध्ययन सीमित छ। त्यसकारण, साइपरमेथ्रिनप्रति अनुरान प्रजातिहरूको संवेदनशीलताको मूल्याङ्कन गर्नु महत्त्वपूर्ण छ।
वातावरणीय प्रदूषणले उभयचरहरूको सामान्य वृद्धि र विकासलाई असर गर्छ, तर सबैभन्दा गम्भीर प्रतिकूल प्रभाव भनेको कीटनाशकको ​​सम्पर्कबाट हुने डीएनएमा हुने आनुवंशिक क्षति हो। रक्त कोष आकारविज्ञान विश्लेषण प्रदूषण र जंगली प्रजातिहरूमा पदार्थको सम्भावित विषाक्तताको एक महत्त्वपूर्ण जैविक सूचक हो। २९। वातावरणमा रसायनहरूको जीनोटक्सिसिटी निर्धारण गर्न माइक्रोन्यूक्लियस परीक्षण सबैभन्दा धेरै प्रयोग हुने विधिहरू मध्ये एक हो। यो एक द्रुत, प्रभावकारी र सस्तो विधि हो जुन उभयचरहरू जस्ता जीवहरूको रासायनिक प्रदूषणको राम्रो सूचक हो। ३१,३२ र जीनोटक्सिक प्रदूषकहरूको सम्पर्कमा जानकारी प्रदान गर्न सक्छ। ३३।
यस अध्ययनको उद्देश्य माइक्रोन्यूक्लियस परीक्षण र पारिस्थितिक जोखिम मूल्याङ्कन प्रयोग गरेर साना जलीय ट्याडपोलहरूमा व्यावसायिक साइपरमेथ्रिन सूत्रहरूको विषाक्त क्षमताको मूल्याङ्कन गर्नु थियो।
परीक्षणको तीव्र अवधिमा व्यावसायिक साइपरमेथ्रिनको विभिन्न सांद्रताको सम्पर्कमा आएका पी. ग्रासिलिस ट्याडपोलहरूको संचयी मृत्युदर (%)।
पुरानो परीक्षणको क्रममा व्यावसायिक साइपरमेथ्रिनको विभिन्न सांद्रताको सम्पर्कमा आएका P. gracilis tadpoles को संचयी मृत्युदर (%)।
साइपरमेथ्रिनको विभिन्न सांद्रता (६ र २० μg/L) को सम्पर्कमा आएका उभयचरहरूमा जीनोटोक्सिक प्रभावहरूको परिणामस्वरूप उच्च मृत्युदर देखिएको थियो, जुन माइक्रोन्यूक्लिए (MN) को उपस्थिति र एरिथ्रोसाइटहरूमा आणविक असामान्यताहरूले प्रमाणित गर्दछ। MN को गठनले माइटोसिसमा त्रुटिहरूलाई संकेत गर्दछ र क्रोमोसोमहरूको माइक्रोट्यूब्युलहरूमा कमजोर बन्धन, क्रोमोसोम अपटेक र यातायातको लागि जिम्मेवार प्रोटीन कम्प्लेक्सहरूमा दोषहरू, क्रोमोसोम पृथकीकरणमा त्रुटिहरू र DNA क्षति मर्मतमा त्रुटिहरूसँग सम्बन्धित छ38,39 र कीटनाशक-प्रेरित अक्सिडेटिभ तनाव40,41 सँग सम्बन्धित हुन सक्छ। मूल्याङ्कन गरिएका सबै सांद्रताहरूमा अन्य असामान्यताहरू अवलोकन गरिएको थियो। साइपरमेथ्रिनको सांद्रता बढाउँदा एरिथ्रोसाइटहरूमा न्यूनतम (१ μg/L) र उच्चतम (२० μg/L) खुराकहरूमा क्रमशः ५% र २०% ले आणविक असामान्यताहरू बढ्यो। उदाहरणका लागि, प्रजातिको DNA मा परिवर्तनले छोटो र दीर्घकालीन दुवै बाँच्नको लागि गम्भीर परिणामहरू निम्त्याउन सक्छ, जसको परिणामस्वरूप जनसंख्यामा गिरावट, प्रजनन फिटनेस परिवर्तन, प्रजनन, आनुवंशिक विविधताको हानि, र परिवर्तन गरिएको माइग्रेसन दरहरू हुन सक्छन्। यी सबै कारकहरूले प्रजातिहरूको अस्तित्व र मर्मतसम्भारलाई असर गर्न सक्छन्42,43। एरिथ्रोइड असामान्यताहरूको गठनले साइटोकिनेसिसमा अवरोधलाई संकेत गर्न सक्छ, जसको परिणामस्वरूप असामान्य कोशिका विभाजन (बाइन्युक्लेटेड एरिथ्रोसाइट्स)44,45 हुन्छ; बहु-लोब्ड न्यूक्लीहरू धेरै लोबहरू भएको आणविक झिल्लीको प्रोट्रुसनहरू हुन्46, जबकि अन्य एरिथ्रोइड असामान्यताहरू डीएनए प्रवर्धनसँग सम्बन्धित हुन सक्छन्, जस्तै आणविक मिर्गौला/ब्लेब्स47। एन्युक्लेटेड एरिथ्रोसाइट्सको उपस्थितिले विशेष गरी दूषित पानीमा बिग्रिएको अक्सिजन यातायातलाई संकेत गर्न सक्छ48,49। एपोप्टोसिसले कोशिका मृत्युलाई संकेत गर्दछ50।
अन्य अध्ययनहरूले पनि साइपरमेथ्रिनको जीनोटोक्सिक प्रभावहरू प्रदर्शन गरेका छन्। काबाना एट अल.५१ ले ९६ घण्टासम्म साइपरमेथ्रिनको उच्च सांद्रता (५००० र १०,००० μg L−१) को सम्पर्कमा आएपछि ओडोन्टोफ्राइनस अमेरिकनस कोषहरूमा माइक्रोन्यूक्ली र बाईन्यूक्लीएटेड कोषहरू र एपोप्टोटिक कोषहरू जस्ता आणविक परिवर्तनहरूको उपस्थिति प्रदर्शन गरे। P. biligonigerus52 र Rhinella arenarum53 मा पनि साइपरमेथ्रिन-प्रेरित एपोप्टोसिस पत्ता लागेको थियो। यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छन् कि साइपरमेथ्रिनको जलीय जीवहरूको दायरामा जीनोटोक्सिक प्रभावहरू छन् र MN र ENA परख उभयचरहरूमा सबलेथल प्रभावहरूको सूचक हुन सक्छ र विषाक्त पदार्थहरूको सम्पर्कमा आएका स्थानीय प्रजातिहरू र जंगली जनसंख्याहरूमा लागू हुन सक्छ।
साइपरमेथ्रिनको व्यावसायिक सूत्रीकरणले उच्च वातावरणीय खतरा (तीव्र र दीर्घकालीन दुवै) निम्त्याउँछ, जसको मुख्यालय अमेरिकी वातावरण संरक्षण एजेन्सी (EPA) स्तर ५४ भन्दा बढी हुन्छ जसले वातावरणमा उपस्थित भएमा प्रजातिहरूलाई प्रतिकूल असर पार्न सक्छ। दीर्घकालीन जोखिम मूल्याङ्कनमा, मृत्युदरको लागि NOEC ३ μg L−१ थियो, जसले पानीमा पाइने सांद्रताले प्रजातिहरूलाई जोखिम निम्त्याउन सक्छ भनेर पुष्टि गर्छ ५५। एन्डोसल्फान र साइपरमेथ्रिनको मिश्रणमा परेको R. एरेनारम लार्भाको लागि घातक NOEC १६८ घण्टा पछि ५०० μg L−१ थियो; यो मान ३३६ घण्टा पछि ०.०००५ μg L−१ मा घट्यो। लेखकहरूले देखाउँछन् कि एक्सपोजर जति लामो हुन्छ, प्रजातिहरूको लागि हानिकारक सांद्रता त्यति नै कम हुन्छ। यो हाइलाइट गर्न पनि महत्त्वपूर्ण छ कि NOEC मानहरू एउटै एक्सपोजर समयमा P. gracilis भन्दा बढी थिए, जसले संकेत गर्दछ कि साइपरमेथ्रिनको लागि प्रजातिको प्रतिक्रिया प्रजाति-विशिष्ट छ। यसबाहेक, मृत्युदरको सन्दर्भमा, साइपरमेथ्रिनको सम्पर्कमा आएपछि P. gracilis को CHQ मान 64.67 मा पुग्यो, जुन अमेरिकी वातावरण संरक्षण एजेन्सी54 द्वारा निर्धारित सन्दर्भ मान भन्दा बढी हो, र R. arenarum लार्भाको CHQ मान पनि यो मान भन्दा बढी थियो (CHQ > 388.00 पछि 336 घण्टा), जसले अध्ययन गरिएका कीटनाशकहरूले धेरै उभयचर प्रजातिहरूको लागि उच्च जोखिम निम्त्याउँछ भन्ने संकेत गर्दछ। P. gracilis लाई मेटामोर्फोसिस पूरा गर्न लगभग 30 दिन लाग्छ भन्ने कुरालाई ध्यानमा राख्दै, यो निष्कर्ष निकाल्न सकिन्छ कि साइपरमेथ्रिनको अध्ययन गरिएको सांद्रताले संक्रमित व्यक्तिहरूलाई कम उमेरमा वयस्क वा प्रजनन चरणमा प्रवेश गर्नबाट रोकेर जनसंख्या गिरावटमा योगदान पुर्‍याउन सक्छ।
माइक्रोन्यूक्लियस र अन्य एरिथ्रोसाइट आणविक असामान्यताहरूको गणना गरिएको जोखिम मूल्याङ्कनमा, CHQ मानहरू 14.92 देखि 97.00 सम्म थिए, जसले साइपरमेथ्रिनको प्राकृतिक बासस्थानमा पनि P. gracilis को लागि सम्भावित जीनोटोक्सिक जोखिम रहेको संकेत गर्दछ। मृत्युदरलाई ध्यानमा राख्दै, P. gracilis लाई सहन सकिने xenobiotic यौगिकहरूको अधिकतम सांद्रता 4.24 μg L−1 थियो। यद्यपि, 1 μg/L भन्दा कम सांद्रताले पनि जीनोटोक्सिक प्रभावहरू देखायो। यो तथ्यले असामान्य व्यक्तिहरूको संख्यामा वृद्धि हुन सक्छ57 र तिनीहरूको बासस्थानमा प्रजातिहरूको विकास र प्रजननलाई असर गर्न सक्छ, जसले गर्दा उभयचर जनसंख्यामा गिरावट आउन सक्छ।
कीटनाशक साइपरमेथ्रिनको व्यावसायिक सूत्रीकरणले पी. ग्रासिलिसलाई उच्च तीव्र र दीर्घकालीन विषाक्तता देखायो। उच्च मृत्युदर अवलोकन गरिएको थियो, सम्भवतः विषाक्त प्रभावहरूको कारणले गर्दा, माइक्रोन्यूक्लिए र एरिथ्रोसाइट आणविक असामान्यताहरू, विशेष गरी दाँतेदार न्यूक्ली, लोब्ड न्यूक्ली, र भेसिकुलर न्यूक्लीहरूको उपस्थितिबाट प्रमाणित। थप रूपमा, अध्ययन गरिएका प्रजातिहरूले तीव्र र दीर्घकालीन दुवै वातावरणीय जोखिमहरू बढेको देखाए। हाम्रो अनुसन्धान समूहद्वारा अघिल्ला अध्ययनहरूसँग मिलाएर यी तथ्याङ्कहरूले देखाएको छ कि साइपरमेथ्रिनको विभिन्न व्यावसायिक सूत्रीकरणहरूले पनि एसिटाइलकोलिनेस्टेरेज (AChE) र ब्युटायरिलकोलिनेस्टेरेज (BChE) गतिविधिहरू र अक्सिडेटिभ तनावमा कमी ल्याएको छ58, र परिणामस्वरूप पी. ग्रासिलिसमा पौडी खेल्ने गतिविधि र मौखिक विकृतिहरूमा परिवर्तन आएको छ59, जसले साइपरमेथ्रिनको व्यावसायिक सूत्रीकरणमा यस प्रजातिको लागि उच्च घातक र सबलेथल विषाक्तता रहेको संकेत गर्दछ। हार्टम्यान एट अल। 60 ले पत्ता लगाए कि साइपरमेथ्रिनको व्यावसायिक सूत्रीकरणहरू पी. ग्रासिलिस र उही जीनसको अर्को प्रजाति (P. cuvieri) को लागि नौ अन्य कीटनाशकहरूको तुलनामा सबैभन्दा विषाक्त थिए। यसले सुझाव दिन्छ कि वातावरणीय संरक्षणको लागि कानुनी रूपमा स्वीकृत साइपरमेथ्रिनको सांद्रताले उच्च मृत्युदर र दीर्घकालीन जनसंख्या गिरावट निम्त्याउन सक्छ।
वातावरणमा पाइने सांद्रताले उच्च मृत्युदर निम्त्याउन सक्छ र पी. ग्रासिलिसको लागि सम्भावित जोखिम निम्त्याउन सक्छ, त्यसैले उभयचर प्रजातिहरूमा अनुसन्धानलाई प्रोत्साहन गरिनुपर्छ, किनकि यी जीवहरूको तथ्याङ्क दुर्लभ छ, विशेष गरी ब्राजिलियन प्रजातिहरूको।
दीर्घकालीन विषाक्तता परीक्षण स्थिर अवस्थामा १६८ घण्टा (७ दिन) सम्म चल्यो र सबलेथल सांद्रताहरू थिए: १, ३, ६ र २० μg ai L−१। दुवै प्रयोगहरूमा, प्रति उपचार समूह १० ट्याडपोलहरू छ प्रतिकृतिहरू सहित मूल्याङ्कन गरिएको थियो, प्रति सांद्रता जम्मा ६० ट्याडपोलहरूको लागि। यसैबीच, पानी-मात्र उपचारले नकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा काम गर्‍यो। प्रत्येक प्रयोगात्मक सेटअपमा ५०० मिलीलीटर क्षमता र प्रति ५० मिलीलीटर घोलमा १ ट्याडपोलको घनत्व भएको बाँझ गिलासको डिश समावेश थियो। वाष्पीकरण रोक्नको लागि फ्लास्कलाई पोलिथिलीन फिल्मले ढाकिएको थियो र निरन्तर वातित गरिएको थियो।
०, ९६ र १६८ घण्टामा कीटनाशक सांद्रता निर्धारण गर्न पानीको रासायनिक विश्लेषण गरिएको थियो। सबिन एट अल ६८ र मार्टिन्स एट अल ६९ का अनुसार, विश्लेषणहरू सान्ता मारियाको संघीय विश्वविद्यालयको कीटनाशक विश्लेषण प्रयोगशाला (LARP) मा ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमेट्री (भेरियन मोडेल १२००, पालो अल्टो, क्यालिफोर्निया, संयुक्त राज्य अमेरिका) सँग जोडिएको ग्यास क्रोमेटोग्राफी प्रयोग गरेर गरिएको थियो। पानीमा कीटनाशकहरूको मात्रात्मक निर्धारण पूरक सामग्रीको रूपमा देखाइएको छ (तालिका SM1)।
माइक्रोन्यूक्लियस परीक्षण (MNT) र रातो कोष आणविक असामान्यता परीक्षण (RNA) को लागि, प्रत्येक उपचार समूहबाट १५ वटा ट्याडपोलहरूको विश्लेषण गरिएको थियो। ट्याडपोलहरूलाई ५% लिडोकेन (५० मिलीग्राम g-१७०) ले बेहोस पारिएको थियो र डिस्पोजेबल हेपरिनाइज्ड सिरिन्ज प्रयोग गरेर कार्डियक पंचरद्वारा रगतको नमूनाहरू सङ्कलन गरिएको थियो। बाँझ माइक्रोस्कोप स्लाइडहरूमा रगतको स्मियरहरू तयार पारिएको थियो, हावामा सुकाइएको थियो, १००% मेथानोल (४ डिग्री सेल्सियस) मा २ मिनेटको लागि फिक्स गरिएको थियो, र त्यसपछि अँध्यारोमा १५ मिनेटको लागि १०% गिम्सा घोलले दाग लगाइएको थियो। प्रक्रियाको अन्त्यमा, स्लाइडहरूलाई अतिरिक्त दाग हटाउन डिस्टिल्ड पानीले धोइयो र कोठाको तापक्रममा सुकाइयो।
प्रत्येक ट्याडपोलबाट कम्तिमा १००० आरबीसीहरू १००× माइक्रोस्कोप प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो जसको उद्देश्य ७१ थियो MN र ENA को उपस्थिति निर्धारण गर्नु थियो। ट्याडपोलबाट कुल ७५,७९६ आरबीसीहरू साइपरमेथ्रिन सांद्रता र नियन्त्रणहरूलाई विचार गर्दै मूल्याङ्कन गरिएको थियो। क्यारास्को एट अल र फेनेच एट अल ३८,७२ को विधि अनुसार निम्न आणविक घावहरूको आवृत्ति निर्धारण गरेर जीनोटोक्सिसिटीको विश्लेषण गरिएको थियो: (१) एन्युक्लिएट कोशिकाहरू: न्यूक्ली बिना कोशिकाहरू; (२) एपोपटोटिक कोशिकाहरू: न्यूक्लियर फ्र्याग्मेन्टेसन, प्रोग्राम गरिएको कोशिका मृत्यु; (३) बाइन्युक्लिएट कोशिकाहरू: दुई न्यूक्ली भएका कोशिकाहरू; (४) न्यूक्लियर बड वा ब्लेब कोशिकाहरू: न्यूक्लियर झिल्लीको सानो प्रोट्रुसन भएका न्यूक्ली भएका कोशिकाहरू, माइक्रोन्यूक्ली जस्तै आकारका ब्लेबहरू; (५) क्यारियोलाइज्ड कोशिकाहरू: आन्तरिक सामग्री बिना न्यूक्लियसको रूपरेखा मात्र भएका कोशिकाहरू; (६) खाच भएका कोशिकाहरू: स्पष्ट दरार वा खाच भएका कोशिकाहरू जसको आकारमा नाभिक पनि भनिन्छ; (७) लोब्युलेटेड कोषहरू: माथि उल्लेखित भेसिकलहरू भन्दा ठूला आणविक प्रोट्रुसनहरू भएका कोषहरू; र (८) सूक्ष्म कोषहरू: सघन केन्द्रक र कम साइटोप्लाज्म भएका कोषहरू। परिवर्तनहरूलाई नकारात्मक नियन्त्रण परिणामहरूसँग तुलना गरिएको थियो।
तीव्र विषाक्तता परीक्षण परिणामहरू (LC50) लाई GBasic सफ्टवेयर र TSK-Trimmed Spearman-Karber विधि74 प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो। पुरानो परीक्षण डेटा त्रुटि सामान्यता (Shapiro-Wilks) र भिन्नताको एकरूपता (Bartlett) को लागि पूर्व-परीक्षण गरिएको थियो। परिणामहरू भिन्नताको एक-तर्फी विश्लेषण (ANOVA) प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो। टुकीको परीक्षण तिनीहरू बीच डेटा तुलना गर्न प्रयोग गरिएको थियो, र डनेटको परीक्षण उपचार समूह र नकारात्मक नियन्त्रण समूह बीच डेटा तुलना गर्न प्रयोग गरिएको थियो।
डनेटको परीक्षण प्रयोग गरेर LOEC र NOEC डेटाको विश्लेषण गरिएको थियो। तथ्याङ्कीय परीक्षणहरू Statistica 8.0 सफ्टवेयर (StatSoft) प्रयोग गरेर ९५% (p < ०.०५) को महत्व स्तरको साथ गरिएको थियो।