मात्रात्मक गिब्बेरेलिन बायोसेन्सरले शूट एपिकल मेरिस्टेममा इन्टरनोड विशिष्टतामा गिब्बेरेलिनको भूमिका प्रकट गर्दछ।

डाँठको संरचनाको लागि गोलीगाँठोको एपिकल मेरिस्टेम (SAM) को वृद्धि महत्वपूर्ण छ। बिरुवाको हर्मोनगिब्बेरेलिन(GAs) ले बिरुवाको वृद्धि समन्वय गर्न प्रमुख भूमिका खेल्छन्, तर SAM मा तिनीहरूको भूमिका राम्रोसँग बुझिएको छैन। यहाँ, हामीले GA ट्रान्सक्रिप्शनल प्रतिक्रियामा यसको आवश्यक नियामक कार्यलाई दबाउन DELLA प्रोटिनलाई इन्जिनियरिङ गरेर GA सिग्नलिङको अनुपातिक बायोसेन्सर विकास गर्यौं र GA पहिचानमा यसको क्षयीकरणलाई सुरक्षित राख्यौं। हामी प्रदर्शन गर्छौं कि यो क्षय-आधारित बायोसेन्सरले विकासको क्रममा GA स्तर र सेलुलर सेन्सिङमा परिवर्तनहरू सही रूपमा रेकर्ड गर्दछ। हामीले SAM मा GA सिग्नलिङ गतिविधि नक्सा गर्न यो बायोसेन्सर प्रयोग गर्यौं। हामी देखाउँछौं कि उच्च GA सिग्नलहरू मुख्यतया अंग प्राइमोर्डिया बीच अवस्थित कोशिकाहरूमा उपस्थित हुन्छन्, जुन इन्टरनोड कोशिकाहरूको अग्रदूत हुन्। लाभ- र हानि-कार्य दृष्टिकोणहरू प्रयोग गरेर, हामी थप प्रदर्शन गर्छौं कि GA ले कोशिका विभाजन विमानको अभिमुखीकरणलाई नियमन गर्दछ, इन्टरनोडहरूको क्यानोनिकल सेलुलर संगठन स्थापना गर्दछ, जसले गर्दा SAM मा इन्टरनोड विशिष्टतालाई बढावा दिन्छ।
अंकुरको माथिल्लो भागमा अवस्थित अंकुरको एपिकल मेरिस्टेम (SAM) मा स्टेम सेलहरूको एक आला हुन्छ जसको गतिविधिले बिरुवाको जीवनभर मोड्युलर र पुनरावृत्ति तरिकाले पार्श्व अंगहरू र स्टेम नोडहरू उत्पन्न गर्दछ। यी प्रत्येक दोहोरिने एकाइहरू, वा बिरुवा नोडहरूमा, नोडहरूमा इन्टरनोडहरू र पार्श्व अंगहरू, र पातको अक्षहरूमा एक्सिलरी मेरिस्टेमहरू समावेश छन्। विकासको क्रममा बिरुवा नोडहरूको वृद्धि र संगठन परिवर्तन हुन्छ। अराबिडोप्सिसमा, वनस्पति चरणको समयमा इन्टरनोडल वृद्धि दबाइन्छ, र एक्सिलरी मेरिस्टेमहरू रोसेट पातहरूको अक्षमा निष्क्रिय रहन्छन्। पुष्प चरणमा संक्रमणको क्रममा, SAM पुष्पक्रम मेरिस्टेम बन्छ, जसले लामो इन्टरनोडहरू र एक्सिलरी कोपिलाहरू, कोलिन पातहरूको अक्षमा शाखाहरू, र पछि, पातविहीन फूलहरू उत्पन्न गर्दछ। यद्यपि हामीले पातहरू, फूलहरू र हाँगाहरूको सुरुवातलाई नियन्त्रण गर्ने संयन्त्रहरू बुझ्नमा महत्त्वपूर्ण प्रगति गरेका छौं, इन्टरनोडहरू कसरी उत्पन्न हुन्छन् भन्ने बारे अपेक्षाकृत थोरै थाहा छ।
GA को स्प्याटियोटेम्पोरल वितरण बुझ्नाले विभिन्न तन्तुहरूमा र विभिन्न विकास चरणहरूमा यी हार्मोनहरूको कार्यहरू राम्रोसँग बुझ्न मद्दत गर्नेछ। यसको आफ्नै प्रमोटरको कार्य अन्तर्गत व्यक्त गरिएको RGA-GFP फ्यूजनको गिरावटको दृश्यावलोकनले जराहरूमा कुल GA स्तरहरूको नियमनमा महत्त्वपूर्ण जानकारी प्रदान गर्दछ15,16। यद्यपि, RGA अभिव्यक्ति तन्तुहरूमा भिन्न हुन्छ17 र GA18 द्वारा नियमन गरिन्छ। यसरी, RGA प्रमोटरको विभेदक अभिव्यक्तिले RGA-GFP सँग अवलोकन गरिएको प्रतिदीप्ति ढाँचामा परिणाम दिन सक्छ र यसरी यो विधि मात्रात्मक छैन। हालसालै, बायोएक्टिभ फ्लोरोसेसिन (Fl)-लेबल गरिएको GA19,20 ले रूट एन्डोकोर्टेक्समा GA को संचय र GA यातायात द्वारा यसको सेलुलर स्तरहरूको नियमन प्रकट गर्‍यो। हालसालै, GA FRET सेन्सर nlsGPS1 ले देखायो कि GA स्तरहरू जरा, फिलामेन्टहरू, र गाढा-बढेको हाइपोकोटाइलहरू21 मा सेल लम्बाइसँग सम्बन्धित छन्। यद्यपि, हामीले देखेका छौं, GA सांद्रता GA संकेतन गतिविधि नियन्त्रण गर्ने एक मात्र प्यारामिटर होइन, किनकि यो जटिल सेन्सिङ प्रक्रियाहरूमा निर्भर गर्दछ। यहाँ, DELLA र GA सिग्नलिङ मार्गहरूको हाम्रो बुझाइमा निर्माण गर्दै, हामी GA सिग्नलिङको लागि डिग्रेडेसन-आधारित रेशियोमेट्रिक बायोसेन्सरको विकास र विशेषता रिपोर्ट गर्छौं। यो मात्रात्मक बायोसेन्सर विकास गर्न, हामीले एक उत्परिवर्ती GA-संवेदनशील RGA प्रयोग गर्यौं जुन फ्लोरोसेन्ट प्रोटीनमा फ्यूज गरिएको थियो र तन्तुहरूमा सर्वव्यापी रूपमा व्यक्त गरिएको थियो, साथै GA-असंवेदनशील फ्लोरोसेन्ट प्रोटीन पनि। हामी देखाउँछौं कि उत्परिवर्ती RGA प्रोटीन फ्यूजनहरूले सर्वव्यापी रूपमा व्यक्त गर्दा अन्तर्जात GA सिग्नलिङमा हस्तक्षेप गर्दैनन्, र यो बायोसेन्सरले उच्च स्प्याटियोटेम्पोरल रिजोलुसनको साथ सेन्सिङ उपकरणद्वारा GA इनपुट र GA सिग्नल प्रशोधन दुवैबाट उत्पन्न हुने सिग्नलिङ गतिविधिको मात्रा निर्धारण गर्न सक्छ। हामीले GA सिग्नलिङ गतिविधिको स्प्याटियोटेम्पोरल वितरण नक्सा गर्न र GA ले SAM एपिडर्मिसमा सेलुलर व्यवहारलाई कसरी नियमन गर्छ भनेर परिमाण गर्न यो बायोसेन्सर प्रयोग गर्यौं। हामी प्रदर्शन गर्छौं कि GA ले अंग प्राइमोर्डिया बीच अवस्थित SAM कोशिकाहरूको डिभिजन प्लेनको अभिमुखीकरणलाई नियमन गर्दछ, जसले गर्दा इन्टरनोडको क्यानोनिकल सेलुलर संगठन परिभाषित हुन्छ।
अन्तमा, हामीले सोध्यौं कि qmRGA ले बढ्दो हाइपोकोटाइलहरू प्रयोग गरेर अन्तर्जात GA स्तरहरूमा परिवर्तनहरू रिपोर्ट गर्न सक्छ कि सक्दैन। हामीले पहिले देखाएका थियौं कि नाइट्रेटले GA संश्लेषण बढाएर वृद्धिलाई उत्तेजित गर्छ र, फलस्वरूप, DELLA34 क्षयीकरण। तदनुसार, हामीले अवलोकन गर्यौं कि प्रचुर मात्रामा नाइट्रेट आपूर्ति (१० mM NO3−) अन्तर्गत उब्जाइएको pUBQ10::qmRGA बिरुवाहरूमा हाइपोकोटाइल लम्बाइ नाइट्रेट-कम अवस्थाहरूमा उब्जाइएको बिरुवाहरूको तुलनामा उल्लेखनीय रूपमा लामो थियो (पूरक चित्र ६a)। वृद्धि प्रतिक्रियासँग मिल्दोजुल्दो, नाइट्रेटको अभावमा उब्जाइएको बिरुवाहरूको तुलनामा १० mM NO3− अवस्थाहरूमा उब्जाइएको बिरुवाहरूको हाइपोकोटाइलहरूमा GA संकेतहरू बढी थिए (पूरक चित्र ६b, c)। यसरी, qmRGA ले GA सांद्रतामा अन्तर्जात परिवर्तनहरूद्वारा प्रेरित GA संकेतनमा परिवर्तनहरूको निगरानीलाई पनि सक्षम बनाउँछ।
सेन्सर डिजाइनको आधारमा अपेक्षित रूपमा qmRGA द्वारा पत्ता लगाइएको GA सिग्नलिङ गतिविधि GA सांद्रता र GA धारणामा निर्भर गर्दछ कि भनेर बुझ्नको लागि, हामीले वनस्पति र प्रजनन तन्तुहरूमा तीन GID1 रिसेप्टरहरूको अभिव्यक्तिको विश्लेषण गर्यौं। बिरुवाहरूमा, GID1-GUS रिपोर्टर लाइनले देखायो कि GID1a र c कोटिलेडनमा अत्यधिक अभिव्यक्त थिए (चित्र 3a–c)। थप रूपमा, सबै तीन रिसेप्टरहरू पातहरू, पार्श्व जरा प्राइमोर्डिया, जरा टिप्स (GID1b को जरा टोपी बाहेक), र भास्कुलर प्रणाली (चित्र 3a–c) मा व्यक्त गरिएको थियो। पुष्पक्रम SAM मा, हामीले GID1b र 1c को लागि मात्र GUS संकेतहरू पत्ता लगायौं (पूरक चित्र 7a–c)। इन सिटु हाइब्रिडाइजेसनले यी अभिव्यक्ति ढाँचाहरूलाई पुष्टि गर्‍यो र थप प्रदर्शन गर्‍यो कि GID1c SAM मा कम स्तरमा समान रूपमा व्यक्त गरिएको थियो, जबकि GID1b ले SAM को परिधिमा उच्च अभिव्यक्ति देखायो (पूरक चित्र 7d–l)। pGID1b::2xmTQ2-GID1b ट्रान्सलेशनल फ्युजनले GID1b अभिव्यक्तिको श्रेणीबद्ध दायरा पनि प्रकट गर्‍यो, SAM को केन्द्रमा कम वा कुनै अभिव्यक्ति नभएको देखि अंग सीमानाहरूमा उच्च अभिव्यक्ति सम्म (पूरक चित्र 7m)। यसरी, GID1 रिसेप्टरहरू तन्तुहरूमा र भित्र समान रूपमा वितरित हुँदैनन्। पछिल्ला प्रयोगहरूमा, हामीले यो पनि अवलोकन गर्यौं कि GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) को अत्यधिक अभिव्यक्तिले बाह्य GA अनुप्रयोगमा हाइपोकोटाइलहरूमा qmRGA को संवेदनशीलता बढायो (चित्र 3d, e)। यसको विपरित, हाइपोकोटाइलमा qd17mRGA द्वारा मापन गरिएको प्रतिदीप्ति GA3 उपचारको लागि असंवेदनशील थियो (चित्र 3f, g)। दुबै परीक्षणहरूको लागि, सेन्सरको द्रुत व्यवहारको मूल्याङ्कन गर्न बिरुवाहरूलाई GA (100 μM GA3) को उच्च सांद्रतासँग उपचार गरिएको थियो, जहाँ GID1 रिसेप्टरमा बाँध्ने क्षमता बढाइएको वा हराएको थियो। यी नतिजाहरूले सँगै पुष्टि गर्छन् कि qmRGA बायोसेन्सरले GA र GA सेन्सरको रूपमा संयुक्त कार्य गर्दछ, र सुझाव दिन्छ कि GID1 रिसेप्टरको विभेदक अभिव्यक्तिले सेन्सरको उत्सर्जनशीलतालाई उल्लेखनीय रूपमा परिमार्जन गर्न सक्छ।
आजसम्म, SAM मा GA संकेतहरूको वितरण अस्पष्ट छ। त्यसकारण, हामीले L1 तह (एपिडर्मिस; चित्र 4a, b, विधिहरू र पूरक विधिहरू हेर्नुहोस्) मा केन्द्रित हुँदै GA संकेत गतिविधिको उच्च-रिजोल्युसन मात्रात्मक नक्सा गणना गर्न qmRGA-अभिव्यक्त गर्ने बिरुवाहरू र pCLV3::mCherry-NLS स्टेम सेल रिपोर्टर35 प्रयोग गर्यौं, किनकि L1 ले SAM वृद्धि नियन्त्रण गर्न प्रमुख भूमिका खेल्छ36। यहाँ, pCLV3::mCherry-NLS अभिव्यक्तिले GA संकेत गतिविधि37 को स्प्याटियोटेम्पोरल वितरणको विश्लेषणको लागि एक निश्चित ज्यामितीय सन्दर्भ बिन्दु प्रदान गर्‍यो। यद्यपि GA लाई पार्श्व अंग विकासको लागि आवश्यक मानिन्छ4, हामीले अवलोकन गर्यौं कि P3 चरण (चित्र 4a, b) बाट सुरु हुने फ्लोरल प्रिमर्डियम (P) मा GA संकेतहरू कम थिए, जबकि युवा P1 र P2 प्रिमर्डियमहरूमा मध्य क्षेत्रमा जस्तै मध्यम गतिविधि थियो (चित्र 4a, b)। उच्च GA सिग्नलिङ गतिविधि अंग प्राइमोर्डियम सीमाहरूमा पत्ता लगाइयो, P1/P2 (सीमाको छेउमा) बाट सुरु भएर P4 मा शिखरमा पुग्यो, साथै प्राइमोर्डिया (चित्र 4a, b र पूरक चित्र 8a, b) बीच अवस्थित परिधीय क्षेत्रका सबै कोषहरूमा। यो उच्च GA सिग्नलिङ गतिविधि एपिडर्मिसमा मात्र नभई L2 र माथिल्लो L3 तहहरूमा पनि अवलोकन गरिएको थियो (पूरक चित्र 8b)। qmRGA प्रयोग गरेर SAM मा पत्ता लगाइएको GA सिग्नलहरूको ढाँचा पनि समयसँगै अपरिवर्तित रह्यो (पूरक चित्र 8c–f, k)। यद्यपि हामीले विस्तृत रूपमा चित्रण गरेका पाँच स्वतन्त्र रेखाहरूबाट T3 बिरुवाहरूको SAM मा qd17mRGA निर्माण व्यवस्थित रूपमा डाउनरेगुलेट गरिएको थियो, हामी pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP निर्माण (पूरक चित्र 8g–j, l) सँग प्राप्त फ्लोरोसेन्स ढाँचाहरूको विश्लेषण गर्न सक्षम भयौं। यस नियन्त्रण रेखामा, SAM मा प्रतिदीप्ति अनुपातमा मात्र सानो परिवर्तनहरू पत्ता लागे, तर SAM केन्द्रमा हामीले TagBFP सँग सम्बन्धित VENUS मा स्पष्ट र अप्रत्याशित कमी देख्यौं। यसले पुष्टि गर्छ कि qmRGA द्वारा अवलोकन गरिएको संकेतन ढाँचाले mRGA-VENUS को GA-निर्भर गिरावटलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ, तर यो पनि देखाउँछ कि qmRGA ले मेरिस्टेम केन्द्रमा GA संकेतन गतिविधिलाई बढाइचढाइ गर्न सक्छ। संक्षेपमा, हाम्रा नतिजाहरूले GA संकेतन ढाँचा प्रकट गर्दछ जसले मुख्य रूपमा प्राइमोर्डियाको वितरणलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ। अन्तर-प्राइमोर्डियल क्षेत्र (IPR) को यो वितरण विकासशील प्राइमोर्डियम र केन्द्रीय क्षेत्र बीच उच्च GA संकेतन गतिविधिको क्रमिक स्थापनाको कारणले हो, जबकि एकै समयमा प्राइमोर्डियममा GA संकेतन गतिविधि घट्छ (चित्र 4c, d)।
GID1b र GID1c रिसेप्टरहरूको वितरण (माथि हेर्नुहोस्) ले सुझाव दिन्छ कि GA रिसेप्टरहरूको विभेदक अभिव्यक्तिले SAM मा GA सिग्नलिंग गतिविधिको ढाँचालाई आकार दिन मद्दत गर्दछ। हामीले सोच्यौं कि GA को विभेदक संचय समावेश हुन सक्छ कि भनेर। यो सम्भावनाको अनुसन्धान गर्न, हामीले nlsGPS1 GA FRET सेन्सर21 प्रयोग गर्यौं। १०० मिनेटको लागि १० μM GA4+7 सँग उपचार गरिएको nlsGPS1 को SAM मा बढेको सक्रियता आवृत्ति पत्ता लाग्यो (पूरक चित्र 9a–e), जसले संकेत गर्दछ कि nlsGPS1 ले SAM मा GA सांद्रतामा परिवर्तनहरूलाई प्रतिक्रिया दिन्छ, जस्तै यो जरामा गर्छ21। nlsGPS1 सक्रियता आवृत्तिको स्थानिय वितरणले SAM को बाहिरी तहहरूमा अपेक्षाकृत कम GA स्तरहरू प्रकट गर्‍यो, तर तिनीहरू केन्द्रमा र SAM को सिमानामा माथि उठाइएको देखाएको थियो (चित्र 4e र पूरक चित्र 9a,c)। यसले सुझाव दिन्छ कि GA पनि SAM मा qmRGA द्वारा प्रकट गरिएको तुलनात्मक स्थानिय ढाँचाको साथ वितरित गरिएको छ। पूरक दृष्टिकोणको रूपमा, हामीले SAM लाई फ्लोरोसेन्ट GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) वा Fl मात्र नकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा व्यवहार गर्यौं। Fl सिग्नल SAM भरि वितरित गरिएको थियो, केन्द्रीय क्षेत्र र प्रिमर्डियम सहित, कम तीव्रतामा भए पनि (चित्र 4j र पूरक चित्र 10d)। यसको विपरित, सबै तीन GA-Fl विशेष गरी प्रिमर्डियम सीमाना भित्र र IPR को बाँकी भागमा फरक-फरक डिग्रीमा जम्मा भयो, GA7-Fl IPR मा सबैभन्दा ठूलो डोमेनमा जम्मा भयो (चित्र 4k र पूरक चित्र 10a,b)। फ्लोरोसेन्स तीव्रताको परिमाणीकरणले Fl-उपचार गरिएको SAM (चित्र 4l र पूरक चित्र 10c) को तुलनामा GA-Fl-उपचार गरिएको SAM मा IPR देखि गैर-IPR तीव्रता अनुपात उच्च थियो भनेर पत्ता लगायो। सँगै, यी परिणामहरूले सुझाव दिन्छन् कि GA अंग सीमानाको नजिक अवस्थित IPR कोषहरूमा उच्च सांद्रतामा उपस्थित छ। यसले सुझाव दिन्छ कि SAM GA सिग्नलिङ गतिविधिको ढाँचा GA रिसेप्टरहरूको विभेदक अभिव्यक्ति र अंग सीमानाहरू नजिक IPR कोषहरूमा GA को विभेदक संचय दुवैबाट उत्पन्न हुन्छ। यसरी, हाम्रो विश्लेषणले GA सिग्नलिङको अप्रत्याशित स्प्याटियोटेम्पोरल ढाँचा प्रकट गर्‍यो, SAM को केन्द्र र प्रिमर्डियममा कम गतिविधि र परिधीय क्षेत्रमा IPR मा उच्च गतिविधिको साथ।
SAM मा भिन्न GA सिग्नलिङ गतिविधिको भूमिका बुझ्नको लागि, हामीले SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS को वास्तविक-समय समय-ल्याप्स इमेजिङ प्रयोग गरेर GA सिग्नलिङ गतिविधि, सेल विस्तार, र सेल विभाजन बीचको सम्बन्धको विश्लेषण गर्यौं। वृद्धि नियमनमा GA को भूमिकालाई ध्यानमा राख्दै, सेल विस्तार प्यारामिटरहरूसँग सकारात्मक सम्बन्ध अपेक्षित थियो। त्यसकारण, हामीले पहिले GA सिग्नलिङ गतिविधि नक्साहरूलाई सेल सतह वृद्धि दरको नक्सासँग तुलना गर्यौं (दिइएको सेलको लागि र विभाजनमा छोरी कोषहरूको लागि सेल विस्तारको शक्तिको लागि प्रोक्सीको रूपमा) र वृद्धि एनिसोट्रोपीको नक्सासँग, जसले सेल विस्तारको दिशात्मकता मापन गर्दछ (यहाँ दिइएको सेलको लागि र विभाजनमा छोरी कोषहरूको लागि पनि प्रयोग गरिएको छ; चित्र 5a, b, विधिहरू र पूरक विधिहरू हेर्नुहोस्)। SAM सेल सतह वृद्धि दरको हाम्रो नक्सा अघिल्लो अवलोकनहरूसँग मिल्दोजुल्दो छ 38,39, सीमामा न्यूनतम वृद्धि दर र विकासशील फूलहरूमा अधिकतम वृद्धि दरहरू (चित्र 5a)। प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) ले देखायो कि GA सिग्नलिङ गतिविधि नकारात्मक रूपमा सेल सतह वृद्धि तीव्रता (चित्र 5c) सँग सम्बन्धित थियो। हामीले यो पनि देखायौं कि GA सिग्नलिङ इनपुट र वृद्धि तीव्रता सहित भिन्नताका मुख्य अक्षहरू उच्च CLV3 अभिव्यक्तिद्वारा निर्धारण गरिएको दिशामा ओर्थोगोनल थिए, जसले बाँकी विश्लेषणहरूमा SAM केन्द्रबाट कोषहरूको बहिष्कार पुष्टि गर्दछ। स्पियरम्यान सहसम्बन्ध विश्लेषणले PCA परिणामहरू (चित्र 5d) पुष्टि गर्‍यो, जसले संकेत गर्दछ कि IPR मा उच्च GA संकेतहरूले उच्च कोष विस्तारमा परिणाम दिएन। यद्यपि, सहसम्बन्ध विश्लेषणले GA सिग्नलिङ गतिविधि र वृद्धि एनिसोट्रोपी (चित्र 5c, d) बीच थोरै सकारात्मक सहसम्बन्ध प्रकट गर्‍यो, जसले सुझाव दिन्छ कि IPR मा उच्च GA सिग्नलिङले कोष वृद्धिको दिशा र सम्भवतः कोष विभाजन विमानको स्थितिलाई प्रभाव पार्छ।
a, b SAM मा औसत सतह वृद्धि (a) र वृद्धि एनिसोट्रोपी (b) को ताप नक्साहरू औसतमा सात स्वतन्त्र बिरुवाहरू भन्दा बढी थिए (क्रमशः कोष विस्तारको शक्ति र दिशाको लागि प्रोक्सीको रूपमा प्रयोग गरिन्छ)। c PCA विश्लेषणमा निम्न चरहरू समावेश थिए: GA संकेत, सतह वृद्धि तीव्रता, सतह वृद्धि एनिसोट्रोपी, र CLV3 अभिव्यक्ति। PCA घटक 1 मुख्यतया सतह वृद्धि तीव्रतासँग नकारात्मक रूपमा सहसम्बन्धित थियो र GA संकेतसँग सकारात्मक रूपमा सहसम्बन्धित थियो। PCA घटक 2 मुख्यतया सतह वृद्धि एनिसोट्रोपीसँग सकारात्मक रूपमा सहसम्बन्धित थियो र CLV3 अभिव्यक्तिसँग नकारात्मक रूपमा सहसम्बन्धित थियो। प्रतिशतहरूले प्रत्येक घटकद्वारा व्याख्या गरिएको भिन्नतालाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। d CZ बाहेक टिस्यु स्केलमा GA संकेत, सतह वृद्धि तीव्रता, र सतह वृद्धि एनिसोट्रोपी बीच स्पियरम्यान सहसम्बन्ध विश्लेषण। दायाँपट्टिको संख्या दुई चरहरू बीचको स्पियरम्यान rho मान हो। ताराहरूले सहसम्बन्ध/नकारात्मक सहसम्बन्ध अत्यधिक महत्त्वपूर्ण भएका केसहरूलाई संकेत गर्दछ। e कन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा Col-0 SAM L1 कोशिकाहरूको 3D दृश्यावलोकन। १० घण्टामा SAM (तर प्राइमोर्डियम होइन) मा बनेका नयाँ कोष भित्ताहरू तिनीहरूको कोण मान अनुसार रंगिएका हुन्छन्। रङ पट्टी तल्लो दायाँ कुनामा देखाइएको छ। इनसेटले ० घण्टामा सम्बन्धित ३D छवि देखाउँछ। प्रयोग समान परिणामहरू सहित दुई पटक दोहोर्याइएको थियो। f बक्स प्लटहरूले IPR र गैर-IPR Col-0 SAM (n = १० स्वतन्त्र बिरुवाहरू) मा कोष विभाजन दरहरू प्रदर्शन गर्दछ। केन्द्र रेखाले मध्यक देखाउँछ, र बक्स सीमाहरूले २५ औं र ७५ औं प्रतिशतकहरू संकेत गर्दछ। व्हिस्कर्सले R सफ्टवेयरसँग निर्धारित न्यूनतम र अधिकतम मानहरू संकेत गर्दछ। P मानहरू वेल्चको दुई-पुच्छर t-परीक्षणको साथ प्राप्त गरिएको थियो। g, h योजनाबद्ध रेखाचित्रले (g) SAM (सेतो डटेड रेखा) को केन्द्रबाट रेडियल दिशाको सम्बन्धमा नयाँ कोष भित्ता (म्याजेन्टा) को कोण कसरी मापन गर्ने भनेर देखाउँछ (केवल तीव्र कोण मानहरू, अर्थात्, ०-९०°, विचार गरिन्छ), र (h) मेरिस्टेम भित्र परिधि/पार्श्व र रेडियल दिशाहरू। i क्रमशः SAM (गाढा नीलो), IPR (मध्यम नीलो), र गैर-IPR (हल्का नीलो) भरि कोशिका विभाजन समतल अभिमुखीकरणको फ्रिक्वेन्सी हिस्टोग्राम। P मानहरू दुई-पुच्छर कोल्मोगोरोभ-स्मिरनोभ परीक्षणद्वारा प्राप्त गरिएको थियो। प्रयोग समान परिणामहरू सहित दुई पटक दोहोर्याइएको थियो। j क्रमशः P3 (हल्का हरियो), P4 (मध्यम हरियो), र P5 (गाढा हरियो) वरिपरि IPR कोशिका विभाजन समतल अभिमुखीकरणको फ्रिक्वेन्सी हिस्टोग्राम। P मानहरू दुई-पुच्छर कोल्मोगोरोभ-स्मिरनोभ परीक्षणद्वारा प्राप्त गरिएको थियो। प्रयोग समान परिणामहरू सहित दुई पटक दोहोर्याइएको थियो।
त्यसकारण, हामीले अर्को पटक परीक्षणको क्रममा नयाँ बनेको कोष भित्ताहरू पहिचान गरेर GA सिग्नलिङ र कोष विभाजन गतिविधि बीचको सम्बन्धको अनुसन्धान गर्यौं (चित्र 5e)। यो दृष्टिकोणले हामीलाई कोष विभाजनको आवृत्ति र दिशा मापन गर्न अनुमति दियो। आश्चर्यजनक रूपमा, हामीले IPR र SAM को बाँकी भाग (गैर-IPR, चित्र 5f) मा कोष विभाजनको आवृत्ति समान रहेको पायौं, जसले IPR र गैर-IPR कोषहरू बीच GA सिग्नलिङमा भिन्नताहरूले कोष विभाजनलाई उल्लेखनीय रूपमा असर गर्दैन भनेर संकेत गर्दछ। यो, र GA सिग्नलिङ र वृद्धि एनिसोट्रोपी बीचको सकारात्मक सम्बन्धले हामीलाई GA सिग्नलिङ गतिविधिले कोष विभाजन समतलको अभिमुखीकरणलाई प्रभाव पार्न सक्छ कि सक्दैन भनेर विचार गर्न प्रेरित गर्‍यो। हामीले मेरिस्टेम केन्द्र र नयाँ कोष भित्ताको केन्द्रलाई जोड्ने रेडियल अक्षको सापेक्षमा तीव्र कोणको रूपमा नयाँ कोष भित्ताको अभिमुखीकरण मापन गर्यौं (चित्र 5e-i) र रेडियल अक्षको सापेक्षमा 90° नजिकको कोणमा कोषहरू विभाजित हुने स्पष्ट प्रवृत्ति अवलोकन गर्यौं, जसमा उच्चतम आवृत्तिहरू 70–80° (23.28%) र 80–90° (22.62%) (चित्र 5e,i) मा अवलोकन गरिएको थियो, जुन परिधि/ट्रान्सभर्स दिशामा कोष विभाजनहरूसँग मेल खान्छ (चित्र 5h)। यस कोष विभाजन व्यवहारमा GA संकेतको योगदानको जाँच गर्न, हामीले IPR र गैर-IPR मा कोष विभाजन प्यारामिटरहरू अलग-अलग विश्लेषण गर्यौं (चित्र 5i)। हामीले अवलोकन गर्यौं कि IPR कोषहरूमा विभाजन कोण वितरण गैर-IPR कोषहरू वा सम्पूर्ण SAM मा कोषहरूमा भन्दा फरक थियो, IPR कोषहरूले पार्श्व/वृत्ताकार कोष विभाजनहरूको उच्च अनुपात प्रदर्शन गरे, अर्थात्, 70-80° र 80-90° (क्रमशः 33.86% र 30.71%, अनुरूप अनुपात) (चित्र 5i)। यसरी, हाम्रो अवलोकनहरूले उच्च GA सिग्नलिंग र परिधि दिशाको नजिक कोष विभाजन विमान अभिमुखीकरण बीचको सम्बन्ध प्रकट गर्‍यो, GA सिग्नलिंग गतिविधि र वृद्धि एनिसोट्रोपी बीचको सम्बन्ध जस्तै (चित्र 5c, d)। यस सम्बन्धको स्थानिक संरक्षणलाई थप स्थापित गर्न, हामीले P3 बाट सुरु हुने प्राइमोर्डियम वरपरका IPR कोषहरूमा विभाजन विमान अभिमुखीकरण मापन गर्यौं, किनकि P4 बाट सुरु हुने यस क्षेत्रमा उच्चतम GA सिग्नलिंग गतिविधि पत्ता लागेको थियो (चित्र 4)। P3 र P4 वरिपरि IPR को विभाजन कोणहरूले कुनै सांख्यिकीय रूपमा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू देखाएनन्, यद्यपि P4 वरिपरि IPR मा पार्श्व कोष विभाजनहरूको बढ्दो आवृत्ति अवलोकन गरिएको थियो (चित्र 5j)। यद्यपि, P5 वरपरको IPR कोषहरूमा, कोष विभाजन समतलको अभिमुखीकरणमा भिन्नता सांख्यिकीय रूपमा महत्त्वपूर्ण भयो, ट्रान्सभर्स कोष विभाजनहरूको आवृत्तिमा तीव्र वृद्धि भयो (चित्र 5j)। सँगै, यी परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि GA सिग्नलिङले SAM मा कोष विभाजनहरूको अभिमुखीकरण नियन्त्रण गर्न सक्छ, जुन अघिल्लो रिपोर्टहरूसँग मेल खान्छ40,41 कि उच्च GA सिग्नलिङले IPR मा कोष विभाजनहरूको पार्श्व अभिमुखीकरणलाई प्रेरित गर्न सक्छ।
IPR मा रहेका कोषहरू प्राइमोर्डियामा नभई इन्टरनोडहरूमा समावेश हुने अनुमान गरिएको छ २,४२,४३। IPR मा कोष विभाजनको ट्रान्सभर्स अभिमुखीकरणले इन्टरनोडहरूमा एपिडर्मल कोषहरूको समानान्तर अनुदैर्ध्य पङ्क्तिहरूको विशिष्ट संगठनमा परिणाम दिन सक्छ। माथि वर्णन गरिएका हाम्रा अवलोकनहरूले सुझाव दिन्छ कि GA सिग्नलिङले कोष विभाजनको दिशालाई नियमन गरेर यस प्रक्रियामा भूमिका खेल्छ।
धेरै DELLA जीनहरूको कार्यमा कमी आउँदा GA प्रतिक्रिया हुन्छ, र यो परिकल्पना परीक्षण गर्न डेला उत्परिवर्तीहरू प्रयोग गर्न सकिन्छ44। हामीले पहिले SAM मा पाँच DELLA जीनहरूको अभिव्यक्ति ढाँचाहरूको विश्लेषण गर्यौं। GUS लाइन45 को ट्रान्सक्रिप्शनल फ्युजनले पत्ता लगायो कि GAI, RGA, RGL1, र RGL2 (धेरै कम हदसम्म) SAM मा व्यक्त गरिएको थियो (पूरक चित्र 11a–d)। इन सिटु हाइब्रिडाइजेसनले थप देखाएको छ कि GAI mRNA विशेष गरी प्राइमोर्डिया र विकासशील फूलहरूमा जम्मा हुन्छ (पूरक चित्र 11e)। RGL1 र RGL3 mRNA SAM क्यानोपी भरि र पुराना फूलहरूमा पत्ता लगाइयो, जबकि RGL2 mRNA सीमा क्षेत्रमा बढी प्रचुर मात्रामा थियो (पूरक चित्र 11f–h)। pRGL3::RGL3-GFP SAM को कन्फोकल इमेजिङले इन सिटु हाइब्रिडाइजेसन द्वारा अवलोकन गरिएको अभिव्यक्ति पुष्टि गर्‍यो र देखायो कि RGL3 प्रोटीन SAM को मध्य भागमा जम्मा हुन्छ (पूरक चित्र 11i)। pRGA::GFP-RGA लाइन प्रयोग गरेर, हामीले यो पनि पत्ता लगायौं कि SAM मा RGA प्रोटिन जम्मा हुन्छ, तर P4 बाट सुरु हुने सीमामा यसको प्रचुरता घट्छ (पूरक चित्र ११j)। उल्लेखनीय रूपमा, RGL3 र RGA को अभिव्यक्ति ढाँचाहरू IPR मा उच्च GA संकेत गतिविधिसँग मिल्दोजुल्दो छन्, जुन qmRGA (चित्र ४) द्वारा पत्ता लगाइएको छ। यसबाहेक, यी डेटाले संकेत गर्दछ कि सबै DELLA हरू SAM मा व्यक्त गरिएका छन् र तिनीहरूको अभिव्यक्ति सामूहिक रूपमा सम्पूर्ण SAM मा फैलिएको छ।
हामीले त्यसपछि वाइल्ड-टाइप SAM (Ler, नियन्त्रण) र gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (ग्लोबल) म्युटेन्टहरूमा कोशिका विभाजन प्यारामिटरहरूको विश्लेषण गर्यौं (चित्र 6a, b)। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, हामीले वाइल्ड प्रकार (चित्र 6c) को तुलनामा डेला ग्लोबल म्युटेन्ट SAM मा कोशिका विभाजन कोण फ्रिक्वेन्सीको वितरणमा सांख्यिकीय रूपमा महत्त्वपूर्ण परिवर्तन अवलोकन गर्यौं। डेला ग्लोबल म्युटेन्टमा यो परिवर्तन 80-90° कोण (34.71% बनाम 24.55%) र कम हदसम्म, 70-80° कोण (23.78% बनाम 20.18%) को आवृत्तिमा वृद्धिको कारणले भएको थियो, अर्थात्, ट्रान्सभर्स सेल डिभिजन (चित्र 6c) सँग मेल खान्छ। डेला ग्लोबल म्युटेन्ट (चित्र 6c) मा गैर-ट्रान्सभर्स डिभिजन (0-60°) को आवृत्ति पनि कम थियो। डेला ग्लोबल म्युटेन्ट (चित्र ६b) को SAM मा ट्रान्सभर्स सेल डिभिजनको फ्रिक्वेन्सी उल्लेखनीय रूपमा बढेको थियो। जंगली प्रकार (चित्र ६d) को तुलनामा डेला ग्लोबल म्युटेन्टमा IPR मा ट्रान्सभर्स सेल डिभिजनको फ्रिक्वेन्सी पनि बढी थियो। IPR क्षेत्र बाहिर, जंगली प्रकारमा सेल डिभिजन कोणहरूको अधिक समान वितरण थियो, जबकि डेला ग्लोबल म्युटेन्टले IPR (चित्र ६e) जस्ता ट्यान्जेन्टियल डिभिजनहरू मन पराउँछन्। हामीले ga2 अक्सिडेज (ga2ox) क्विन्टुपल म्युटेन्टहरू (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, र ga2ox6-2) को SAM मा सेल डिभिजनको अभिमुखीकरण पनि परिमाणित गर्यौं, जुन GA-निष्क्रिय उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि हो जसमा GA जम्मा हुन्छ। GA स्तरमा भएको वृद्धिसँग मिल्दोजुल्दो, क्विन्टुपल ga2ox उत्परिवर्ती पुष्पक्रमको SAM Col-0 (पूरक चित्र १२a, b) भन्दा ठूलो थियो, र Col-0 को तुलनामा, क्विन्टुपल ga2ox SAM ले कोशिका विभाजन कोणहरूको स्पष्ट रूपमा फरक वितरण देखायो, कोण आवृत्ति ५०° बाट ९०° सम्म बढ्यो, अर्थात् फेरि स्पर्शिक विभाजनको पक्षमा (पूरक चित्र १२a–c)। यसरी, हामी देखाउँछौं कि GA सिग्नलिङ र GA संचयको संवैधानिक सक्रियताले IPR र SAM को बाँकी भागमा पार्श्व कोशिका विभाजनहरूलाई प्रेरित गर्छ।
a, b कन्फोकल माइक्रोस्कोपी प्रयोग गरेर PI-दागिएको Ler (a) र ग्लोबल डेला म्युटेन्ट (b) SAM को L1 तहको 3D दृश्यावलोकन। 10-घण्टा अवधिमा SAM (तर प्रिमर्डियम होइन) मा बनेका नयाँ कोशिका पर्खालहरू तिनीहरूको कोण मानहरू अनुसार देखाइन्छ र रंग लगाइन्छ। इनसेटले 0 घण्टामा SAM देखाउँछ। रङ पट्टी तल्लो दायाँ कुनामा प्रदर्शित हुन्छ। (b) मा रहेको तीरले ग्लोबल डेला म्युटेन्टमा पङ्क्तिबद्ध सेल फाइलहरूको उदाहरणलाई औंल्याउँछ। प्रयोग समान परिणामहरूको साथ दुई पटक दोहोर्याइएको थियो। ce Ler र ग्लोबल डेला बीच सम्पूर्ण SAM (d), IPR (e), र गैर-IPR (f) मा सेल डिभिजन प्लेन अभिमुखीकरणको फ्रिक्वेन्सी वितरणको तुलना। P मानहरू दुई-पुच्छर कोल्मोगोरोभ-स्मिरनोभ परीक्षण प्रयोग गरेर प्राप्त गरिएको थियो। f, g Col-0 (i) र pCUC2::gai-1-VENUS (j) ट्रान्सजेनिक प्लान्टहरूको PI-दागिएको SAM को कन्फोकल छविहरूको 3D दृश्यावलोकन। प्यानलहरू (a, b) ले १० घण्टा भित्र SAM मा बनेको नयाँ कोष भित्ताहरू (तर प्राइमोर्डिया होइन) देखाउँछन्। प्रयोग समान परिणामहरू सहित दुई पटक दोहोर्याइएको थियो। h–j Col-0 र pCUC2::gai-1-VENUS बिरुवाहरू बीच सम्पूर्ण SAM (h), IPR (i) र गैर-IPR (j) मा अवस्थित कोष विभाजन समतल अभिमुखीकरणहरूको आवृत्ति वितरणको तुलना। P मानहरू दुई-पुच्छर कोल्मोगोरोभ-स्मिरनोभ परीक्षण प्रयोग गरेर प्राप्त गरिएको थियो।
हामीले त्यसपछि IPR मा विशेष गरी GA सिग्नलिङलाई अवरोध गर्ने प्रभावको परीक्षण गर्यौं। यस उद्देश्यका लागि, हामीले VENUS मा फ्युज गरिएको प्रमुख नकारात्मक gai-1 प्रोटीनको अभिव्यक्ति चलाउन cotyledon cup 2 (CUC2) प्रमोटर प्रयोग गर्यौं (pCUC2::gai-1-VENUS लाइनमा)। जंगली-प्रकारको SAM मा, CUC2 प्रमोटरले P4 देखि सीमा कोषहरू सहित SAM मा धेरैजसो IPR हरूको अभिव्यक्ति चलाउँछ, र pCUC2::gai-1-VENUS बिरुवाहरूमा समान विशिष्ट अभिव्यक्ति अवलोकन गरिएको थियो (तल हेर्नुहोस्)। SAM भरि कोशिका विभाजन कोणहरूको वितरण वा pCUC2::gai-1-VENUS बिरुवाहरूको IPR जंगली प्रकारको भन्दा उल्लेखनीय रूपमा फरक थिएन, यद्यपि अप्रत्याशित रूपमा हामीले फेला पार्यौं कि यी बिरुवाहरूमा IPR बिना कोशिकाहरू 80-90° को उच्च आवृत्तिमा विभाजित छन् (चित्र 6f-j)।
कोष विभाजनको दिशा SAM को ज्यामितिमा निर्भर गर्दछ भन्ने सुझाव दिइएको छ, विशेष गरी तन्तु वक्रता द्वारा उत्पन्न तन्य तनाव46। त्यसैले हामीले सोध्यौं कि डेला ग्लोबल म्युटेन्ट र pCUC2::gai-1-VENUS बिरुवाहरूमा SAM को आकार परिवर्तन गरिएको थियो कि थिएन। पहिले रिपोर्ट गरिएझैं12, डेला ग्लोबल म्युटेन्ट SAM को आकार जंगली प्रकारको भन्दा ठूलो थियो (पूरक चित्र 13a, b, d)। CLV3 र STM RNA को इन सिटु हाइब्रिडाइजेसनले डेला म्युटेन्टहरूमा मेरिस्टेम विस्तार पुष्टि गर्‍यो र स्टेम सेल आलाको पार्श्व विस्तारलाई थप देखायो (पूरक चित्र 13e, f, h, i)। यद्यपि, SAM वक्रता दुवै जीनोटाइपहरूमा समान थियो (पूरक चित्र 13k, m, n, p)। हामीले जंगली प्रकारको तुलनामा वक्रतामा परिवर्तन बिना gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant मा आकारमा समान वृद्धि देख्यौं (पूरक चित्र 13c, d, g, j, l, o, p)। डेला क्वाड्रपल म्युटेन्टमा कोशिका विभाजन अभिमुखीकरणको आवृत्ति पनि प्रभावित भएको थियो, तर डेला मोनोलिथिक म्युटेन्टको तुलनामा कम हदसम्म (पूरक चित्र 12d–f)। यो खुराक प्रभाव, वक्रतामा प्रभावको अभावसँगै, डेला क्वाड्रपल म्युटेन्टमा अवशिष्ट RGL3 गतिविधिले DELLA गतिविधिको हानिले हुने कोशिका विभाजन अभिमुखीकरणमा परिवर्तनहरूलाई सीमित गर्दछ र पार्श्व कोशिका विभाजनमा परिवर्तनहरू SAM ज्यामितिमा परिवर्तनको सट्टा GA संकेतन गतिविधिमा परिवर्तनहरूको प्रतिक्रियामा हुन्छन् भन्ने सुझाव दिन्छ। माथि वर्णन गरिएझैं, CUC2 प्रवर्द्धकले P4 बाट सुरु हुने SAM मा IPR अभिव्यक्ति चलाउँछ (पूरक चित्र 14a, b), र यसको विपरीत, pCUC2::gai-1-VENUS SAM को आकार कम थियो तर वक्रता उच्च थियो (पूरक चित्र 14c–h)। pCUC2::gai-1-VENUS SAM आकारविज्ञानमा यो परिवर्तनले जंगली प्रकारको तुलनामा यान्त्रिक तनावको फरक वितरणमा परिणाम दिन सक्छ, जसमा उच्च परिधि तनाव SAM केन्द्रबाट छोटो दूरीमा सुरु हुन्छ47। वैकल्पिक रूपमा, pCUC2::gai-1-VENUS SAM आकारविज्ञानमा परिवर्तनहरू ट्रान्सजीन अभिव्यक्ति48 द्वारा प्रेरित क्षेत्रीय यान्त्रिक गुणहरूमा परिवर्तनहरूको परिणाम हुन सक्छ। दुबै अवस्थामा, यसले हाम्रो अवलोकनहरू व्याख्या गर्दै, परिधि/ट्रान्सभर्स अभिमुखीकरणमा कोशिकाहरू विभाजित हुने सम्भावना बढाएर GA सिग्नलिङमा परिवर्तनहरूको प्रभावलाई आंशिक रूपमा अफसेट गर्न सक्छ।
एकसाथ लिँदा, हाम्रो डेटाले पुष्टि गर्छ कि उच्च GA सिग्नलिङले IPR मा कोष विभाजन समतलको पार्श्व अभिमुखीकरणमा सक्रिय भूमिका खेल्छ। तिनीहरूले यो पनि देखाउँछन् कि मेरिस्टेम वक्रताले IPR मा कोष विभाजन समतलको अभिमुखीकरणलाई पनि प्रभाव पार्छ।
IPR मा डिभिजन प्लेनको ट्रान्सभर्स ओरिएन्टेशन, उच्च GA सिग्नलिङ गतिविधिको कारणले गर्दा, सुझाव दिन्छ कि GA ले SAM भित्र एपिडर्मिसमा रेडियल सेल फाइललाई पूर्व-व्यवस्थित गर्दछ जसले सेलुलर संगठनलाई परिभाषित गर्दछ जुन पछि एपिडर्मल इन्टरनोडमा फेला पर्नेछ। वास्तवमा, त्यस्ता सेल फाइलहरू डेला ग्लोबल म्युटेन्टहरूको SAM छविहरूमा बारम्बार देखिन्थे (चित्र 6b)। यसरी, SAM मा GA सिग्नलिङको स्थानिक ढाँचाको विकासात्मक कार्यलाई थप अन्वेषण गर्न, हामीले वाइल्ड-टाइप (Ler र Col-0), डेला ग्लोबल म्युटेन्टहरू, र pCUC2::gai-1-VENUS ट्रान्सजेनिक प्लान्टहरूमा IPR मा कोशिकाहरूको स्थानिक संगठनको विश्लेषण गर्न टाइम-ल्याप्स इमेजिङ प्रयोग गर्यौं।
हामीले पत्ता लगायौं कि qmRGA ले IPR मा GA सिग्नलिङ गतिविधि P1/P2 बाट बढेर P4 मा पुगेको देखाएको छ, र यो ढाँचा समयसँगै स्थिर रह्यो (चित्र 4a–f र पूरक चित्र 8c–f, k)। बढ्दो GA सिग्नलको साथ IPR मा कोषहरूको स्थानिय संगठनको विश्लेषण गर्न, हामीले पहिलो अवलोकन पछि 34 घण्टा विश्लेषण गरिएको विकासात्मक भाग्य अनुसार माथि र P4 को छेउमा Ler IPR कोषहरूलाई लेबल गर्यौं, अर्थात्, दुई भन्दा बढी प्लास्टिड समय, जसले हामीलाई P1/P2 देखि P4 सम्म प्रिमोडियम विकासको क्रममा IPR कोषहरू पछ्याउन अनुमति दियो। हामीले तीन फरक रङहरू प्रयोग गर्यौं: P4 नजिकै प्रिमोडियममा एकीकृत भएका कोषहरूको लागि पहेंलो, IPR मा भएकाहरूको लागि हरियो, र दुवै प्रक्रियाहरूमा भाग लिनेहरूको लागि बैजनी (चित्र 7a–c)। t0 (0 h) मा, P4 (चित्र 7a) को अगाडि IPR कोषहरूको 1-2 तहहरू देखिन्थे। अपेक्षा गरिए अनुसार, जब यी कोषहरू विभाजित भए, तिनीहरूले मुख्यतया ट्रान्सभर्स डिभिजन प्लेन मार्फत त्यसो गरे (चित्र 7a–c)। Col-0 SAM प्रयोग गरेर समान परिणामहरू प्राप्त गरियो (P3 मा केन्द्रित गर्दै, जसको सीमा Ler मा P4 जस्तै फोल्ड हुन्छ), यद्यपि यस जीनोटाइपमा फ्लोरल बोर्डरमा बनेको फोल्डले IPR कोषहरूलाई अझ छिटो लुकायो (चित्र 7g–i)। यसरी, IPR कोषहरूको विभाजन ढाँचाले कोषहरूलाई रेडियल पङ्क्तिहरूमा पूर्व-व्यवस्थित गर्दछ, जस्तै इन्टरनोडहरूमा। रेडियल पङ्क्तिहरूको संगठन र क्रमिक अंगहरू बीच IPR कोषहरूको स्थानीयकरणले सुझाव दिन्छ कि यी कोषहरू इन्टरनोडल प्रोजेनिटरहरू हुन्।
यहाँ, हामीले एक अनुपातिक GA सिग्नलिंग बायोसेन्सर, qmRGA विकास गर्यौं, जसले GA र GA रिसेप्टर सांद्रताबाट उत्पन्न हुने GA सिग्नलिंग गतिविधिको मात्रात्मक म्यापिङलाई अनुमति दिन्छ जबकि अन्तर्जात सिग्नलिंग मार्गहरूमा हस्तक्षेप कम गर्दछ, जसले गर्दा सेलुलर स्तरमा GA प्रकार्यको बारेमा जानकारी प्रदान गर्दछ। यस उद्देश्यका लागि, हामीले एक परिमार्जित DELLA प्रोटीन, mRGA निर्माण गर्यौं, जसले DELLA अन्तरक्रिया साझेदारहरूलाई बाँध्ने क्षमता गुमाएको छ तर GA-प्रेरित प्रोटियोलिसिस प्रति संवेदनशील रहन्छ। qmRGA ले GA स्तरहरूमा बाह्य र अन्तर्जात दुवै परिवर्तनहरूलाई प्रतिक्रिया दिन्छ, र यसको गतिशील सेन्सिंग गुणहरूले विकासको क्रममा GA सिग्नलिंग गतिविधिमा स्प्याटियोटेम्पोरल परिवर्तनहरूको मूल्याङ्कन सक्षम गर्दछ। qmRGA पनि एक धेरै लचिलो उपकरण हो किनकि यसलाई यसको अभिव्यक्तिको लागि प्रयोग गरिएको प्रमोटर (यदि आवश्यक भएमा) परिवर्तन गरेर विभिन्न तन्तुहरूमा अनुकूलित गर्न सकिन्छ, र GA सिग्नलिंग मार्गको संरक्षित प्रकृति र एंजियोस्पर्महरूमा PFYRE मोटिफलाई दिइएको छ, यो अन्य प्रजातिहरूमा स्थानान्तरण योग्य हुने सम्भावना छ। यससँग मिल्दोजुल्दो, चामल SLR1 DELLA प्रोटीन (HYY497AAA) मा एक समान उत्परिवर्तनले SLR1 को वृद्धि दमन गर्ने गतिविधिलाई दबाउन पनि देखाएको थियो जबकि mRGA23 जस्तै यसको GA-मध्यस्थता गिरावटलाई थोरै मात्र कम गर्‍यो। उल्लेखनीय रूपमा, Arabidopsis मा हालैका अध्ययनहरूले देखाए कि PFYRE डोमेन (S474L) मा एकल एमिनो एसिड उत्परिवर्तनले ट्रान्सक्रिप्शनल गतिविधिलाई ट्रान्सक्रिप्शनल कारक साझेदारहरूसँग अन्तर्क्रिया गर्ने क्षमतालाई असर नगरी परिवर्तन गर्‍यो। यद्यपि यो उत्परिवर्तन mRGA मा उपस्थित 3 एमिनो एसिड प्रतिस्थापनहरूको धेरै नजिक छ, हाम्रो अध्ययनहरूले देखाउँछ कि यी दुई उत्परिवर्तनहरूले DELLA को विशिष्ट विशेषताहरूलाई परिवर्तन गर्छन्। यद्यपि धेरैजसो ट्रान्सक्रिप्शन कारक साझेदारहरू DELLA26,51 को LHR1 र SAW डोमेनहरूमा बाँधिन्छन्, PFYRE डोमेनमा केही संरक्षित एमिनो एसिडहरूले यी अन्तरक्रियाहरूलाई स्थिर गर्न मद्दत गर्न सक्छन्।
इन्टरनोड विकास बिरुवा वास्तुकला र उपज सुधारमा एक प्रमुख विशेषता हो। qmRGA ले IPR इन्टरनोड प्रोजेनिटर कोशिकाहरूमा उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि प्रकट गर्‍यो। मात्रात्मक इमेजिंग र आनुवंशिकी संयोजन गरेर, हामीले देखायौं कि GA सिग्नलिंग ढाँचाहरूले SAM एपिडर्मिसमा गोलाकार/ट्रान्सभर्स सेल डिभिजन प्लेनहरू सुपरइम्पोज गर्छन्, जसले इन्टरनोड विकासको लागि आवश्यक सेल डिभिजन संगठनलाई आकार दिन्छ। विकासको क्रममा सेल डिभिजन प्लेन अभिमुखीकरणका धेरै नियामकहरू पहिचान गरिएका छन्52,53। हाम्रो कामले GA सिग्नलिंग गतिविधिले यो सेलुलर प्यारामिटरलाई कसरी नियमन गर्छ भन्ने कुराको स्पष्ट उदाहरण प्रदान गर्दछ। DELLA ले प्रिफोल्डिंग प्रोटीन कम्प्लेक्सहरूसँग अन्तर्क्रिया गर्न सक्छ41, त्यसैले GA सिग्नलिंगले कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युल अभिमुखीकरणलाई प्रत्यक्ष रूपमा प्रभाव पारेर सेल डिभिजन प्लेन अभिमुखीकरणलाई नियमन गर्न सक्छ40,41,54,55। हामीले अप्रत्याशित रूपमा देखायौं कि SAM मा, उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधिको सहसम्बन्ध सेल लम्बाइ वा विभाजन थिएन, तर केवल वृद्धि एनिसोट्रोपी थियो, जुन IPR मा सेल डिभिजनको दिशामा GA को प्रत्यक्ष प्रभावसँग मिल्दोजुल्दो छ। यद्यपि, हामी यो प्रभाव अप्रत्यक्ष पनि हुन सक्छ भनेर बहिष्कार गर्न सक्दैनौं, उदाहरणका लागि GA-प्रेरित कोशिका भित्ता नरमपन द्वारा मध्यस्थता56। कोशिका भित्ता गुणहरूमा परिवर्तनले यान्त्रिक तनाव57,58 लाई प्रेरित गर्दछ, जसले कोर्टिकल माइक्रोट्यूब्युलहरूको अभिमुखीकरणलाई असर गरेर कोशिका विभाजन समतलको अभिमुखीकरणलाई पनि प्रभाव पार्न सक्छ39,46,59। GA-प्रेरित मेकानिकल तनाव र GA द्वारा माइक्रोट्यूब्युल अभिमुखीकरणको प्रत्यक्ष नियमनको संयुक्त प्रभावहरू इन्टरनोडहरू परिभाषित गर्न IPR मा कोशिका विभाजन अभिमुखीकरणको एक विशिष्ट ढाँचा उत्पन्न गर्न संलग्न हुन सक्छ, र यो विचार परीक्षण गर्न थप अध्ययनहरू आवश्यक छ। त्यस्तै गरी, अघिल्ला अध्ययनहरूले इन्टरनोड गठनको नियन्त्रणमा DELLA-अन्तर्क्रियात्मक प्रोटीन TCP14 र 15 को महत्त्वलाई हाइलाइट गरेको छ60,61 र यी कारकहरूले BREVIPEDICELLUS (BP) र PENNYWISE (PNY) सँगसँगै GA को कार्यलाई मध्यस्थता गर्न सक्छन्, जसले इन्टरनोड विकासलाई नियमन गर्दछ र GA संकेतनलाई प्रभाव पारेको देखाइएको छ2,62। DELLA ले ब्रासिनोस्टेरोइड, इथिलीन, ज्यास्मोनिक एसिड, र एब्सिसिक एसिड (ABA) संकेत मार्गहरूसँग अन्तरक्रिया गर्ने र यी हार्मोनहरूले माइक्रोट्यूब्युल अभिमुखीकरणलाई प्रभाव पार्न सक्ने भएकाले, कोष विभाजन अभिमुखीकरणमा GA को प्रभाव अन्य हार्मोनहरूद्वारा पनि मध्यस्थता हुन सक्छ।
प्रारम्भिक साइटोलोजिकल अध्ययनहरूले देखाए कि अराबिडोप्सिस SAM को भित्री र बाहिरी क्षेत्रहरू दुवै इन्टरनोड विकासको लागि आवश्यक छन्2,42। GA ले भित्री तन्तुहरूमा कोशिका विभाजनलाई सक्रिय रूपमा नियमन गर्दछ भन्ने तथ्यले SAM मा मेरिस्टेम र इन्टरनोड आकारलाई नियमन गर्न GA को दोहोरो कार्यलाई समर्थन गर्दछ। दिशात्मक कोशिका विभाजनको ढाँचा भित्री SAM तन्तुमा पनि कडा रूपमा नियमन गरिएको छ, र यो नियमन स्टेम वृद्धिको लागि आवश्यक छ52। यो जाँच गर्न रोचक हुनेछ कि GA ले भित्री SAM संगठनमा कोशिका विभाजन समतललाई अभिमुखीकरण गर्न पनि भूमिका खेल्छ, जसले गर्दा SAM भित्र इन्टरनोडहरूको विशिष्टता र विकासलाई समक्रमण गर्दछ।
बिरुवाहरू माटोमा इन भिट्रो वा १x मुराशिगे-स्कूग (एमएस) माध्यम (डुचेफा) मा १% सुक्रोज र १% अगर (सिग्मा) मानक अवस्था (१६ घण्टा प्रकाश, २२ डिग्री सेल्सियस) अन्तर्गत उब्जाइएको थियो, हाइपोकोटाइल र जरा वृद्धि प्रयोगहरू बाहेक जसमा बिरुवाहरू स्थिर प्रकाश र २२ डिग्री सेल्सियसमा ठाडो प्लेटहरूमा उब्जाइएको थियो। नाइट्रेट प्रयोगहरूको लागि, बिरुवाहरू परिमार्जित एमएस माध्यम (बायोवर्ल्ड बिरुवा माध्यम) मा उब्जाइएको थियो जसमा पर्याप्त नाइट्रेट (० वा १० मिमी KNO3), ०.५ मिमी NH4-सक्सीनेट, १% सुक्रोज र १% ए-अगर (सिग्मा) लामो-दिनको अवस्थामा पूरक गरिएको थियो।
pDONR221 मा घुसाइएको GID1a cDNA लाई pDONR P4-P1R-pUBQ10 र pDONR P2R-P3-mCherry सँग pB7m34GW मा पुन: संयोजन गरियो ताकि pUBQ10::GID1a-mCherry उत्पन्न होस्। pDONR221 मा घुसाइएको IDD2 DNA लाई p35S:IDD2-RFP उत्पन्न होस् भनेर pB7RWG266 मा पुन: संयोजन गरियो। pGID1b::2xmTQ2-GID1b उत्पन्न गर्न, GID1b कोडिङ क्षेत्रको माथिल्लो भागमा रहेको ३.९ kb को खण्ड र GID1b cDNA (१.३ kb) र टर्मिनेटर (३.४ kb) भएको ४.७ kb को खण्डलाई पहिले पूरक तालिका ३ मा भएका प्राइमरहरू प्रयोग गरेर प्रवर्द्धन गरिएको थियो र त्यसपछि क्रमशः pDONR P4-P1R (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) र pDONR P2R-P3 (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) मा घुसाइएको थियो, र अन्तमा गेटवे क्लोनिङ प्रयोग गरेर pGreen ०१२५६७ लक्षित भेक्टरमा pDONR२२१ २xmTQ२६८ सँग पुन: संयोजन गरिएको थियो। pCUC2::LSSmOrange उत्पन्न गर्न, CUC2 प्रमोटर अनुक्रम (ATG को 3229 bp अपस्ट्रीम) र त्यसपछि N7 आणविक स्थानीयकरण संकेत र NOS ट्रान्सक्रिप्शनल टर्मिनेटरको साथ ठूलो स्टोक्स-शिफ्ट गरिएको mOrange (LSSmOrange)69 को कोडिंग अनुक्रम गेटवे 3-फ्र्याग्मेन्ट रिकोम्बिनेसन प्रणाली (इनभिट्रोजन) प्रयोग गरेर pGreen kanamycin लक्ष्यीकरण भेक्टरमा भेला गरियो। प्लान्ट बाइनरी भेक्टरलाई Agrobacterium tumefaciens स्ट्रेन GV3101 मा परिचय गराइएको थियो र Agrobacterium घुसपैठ विधिद्वारा निकोटियाना बेन्थामियाना पातहरूमा र फ्लोरल डिप विधिद्वारा Arabidopsis thaliana Col-0 मा परिचय गराइएको थियो। pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry र pCLV3::mCherry-NLS qmRGA क्रमशः सम्बन्धित क्रसहरूको F3 र F1 सन्तानहरूबाट अलग गरिएको थियो।
लगभग १ सेमी लामो गोली टिप्स ७२ मा आरएनए इन सिटु हाइब्रिडाइजेसन गरिएको थियो, जुन सङ्कलन गरिएको थियो र तुरुन्तै FAA घोल (३.७% फॉर्मल्डिहाइड, ५% एसिटिक एसिड, ५०% इथेनॉल) मा ४ डिग्री सेल्सियसमा पूर्व-चिसो पारिएको थियो। २ × १५ मिनेट भ्याकुम उपचार पछि, फिक्सेटिभ परिवर्तन गरिएको थियो र नमूनाहरू रातभर इन्क्युबेट गरिएको थियो। GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, र RGL3 cDNA हरू र तिनीहरूका ३′-UTR हरूमा एन्टिसेन्स प्रोबहरू रोसियर एट अल द्वारा वर्णन गरिए अनुसार पूरक तालिका ३ मा देखाइएका प्राइमरहरू प्रयोग गरेर संश्लेषित गरिएको थियो। ७३। डिगोक्सिजेनिन-लेबल गरिएका प्रोबहरूलाई डिगोक्सिजेनिन एन्टिबडीहरू (३०००-फोल्ड डिल्युसन; रोचे, क्याटलग नम्बर: ११ ०९३ २७४ ९१०) प्रयोग गरेर इम्युनोडेक्ट गरिएको थियो, र खण्डहरूलाई ५-ब्रोमो-४-क्लोरो-३-इन्डोलिल फस्फेट (BCIP, २५०-फोल्ड डिल्युसन)/नाइट्रोब्लू टेट्राजोलियम (NBT, २००-फोल्ड डिल्युसन) घोलले दाग लगाइएको थियो।