सेन्ट जोन्स वर्टमा इन भिट्रो अर्गोनेजेनेसिस र बायोएक्टिभ यौगिकहरूको उत्पादनमा बिरुवा वृद्धि नियामकहरू र आइरन अक्साइड न्यानोपार्टिकल्सको सिनर्जिस्टिक प्रभावहरू।

यस अध्ययनमा, संयुक्त उपचारको उत्तेजक प्रभावहरूबिरुवा वृद्धि नियामकहरू*हाइपरिकम पर्फोरेटम* एल. मा इन भिट्रो मोर्फोजेनेसिस र माध्यमिक मेटाबोलाइट उत्पादनमा (२,४-डी र किनेटिन) र आइरन अक्साइड न्यानोपार्टिकल्स (Fe₃O₄-NPs) को अनुसन्धान गरियो। अनुकूलित उपचार [२,४-डी (०.५ मिलीग्राम/लिटर) + किनेटिन (२ मिलीग्राम/लिटर) + Fe₃O₄-NPs (४ मिलीग्राम/लिटर)] ले बिरुवाको वृद्धि प्यारामिटरहरूमा उल्लेखनीय सुधार ल्यायो: नियन्त्रण समूहको तुलनामा बिरुवाको उचाइ ५९.६%, जराको लम्बाइ ११४.०%, कोपिला संख्या १८०.०%, र कलसको ताजा तौल १९८.३% ले बढ्यो। यो संयुक्त उपचारले पुनर्जनन दक्षता (५०.८५%) लाई पनि बढायो र हाइपरिसिन सामग्री ६६.६% ले बढायो। GC-MS विश्लेषणले हाइपरसाइड, β-प्याथोलिन र सेटाइल अल्कोहलको उच्च सामग्री पत्ता लगायो, जुन कुल शिखर क्षेत्रको ९३.३६% हो, जबकि कुल फेनोलिक्स र फ्लेभोनोइड्सको सामग्री ८०.१% ले बढेको छ। यी नतिजाहरूले संकेत गर्दछ कि बिरुवा वृद्धि नियामकहरू (PGRs) र Fe₃O₄ न्यानोपार्टिकल्स (Fe₃O₄-NPs) ले अर्गोजेनेसिसलाई उत्तेजित गरेर र जैविक सक्रिय यौगिकहरूको संचय गरेर एक समन्वयात्मक प्रभाव पार्छ, जसले औषधीय बिरुवाहरूको जैविक प्रविधि सुधारको लागि एक आशाजनक रणनीति प्रतिनिधित्व गर्दछ।
सेन्ट जोन्स वर्ट (हाइपरिकम पर्फोरेटम एल.), जसलाई सेन्ट जोन्स वर्ट पनि भनिन्छ, हाइपरिकासी परिवारको एक बारहमासी जडिबुटी बिरुवा हो जसको आर्थिक मूल्य छ।[1] यसको सम्भावित जैविक रूपमा सक्रिय घटकहरूमा प्राकृतिक ट्यानिन, जान्थोन, फ्लोरोग्लुसिनोल, नेफ्थालेनेडियनथ्रोन (हाइपरिन र स्यूडोहाइपरिन), फ्लेभोनोइड्स, फेनोलिक एसिड र आवश्यक तेलहरू समावेश छन्।[2,3,4] सेन्ट जोन्स वर्ट परम्परागत विधिहरूद्वारा प्रचार गर्न सकिन्छ; यद्यपि, परम्परागत विधिहरूको मौसमीता, कम बीउ अंकुरण, र रोगहरूको संवेदनशीलताले यसको ठूलो मात्रामा खेती र माध्यमिक मेटाबोलाइटहरूको निरन्तर गठनको सम्भावनालाई सीमित गर्दछ।[1,5,6]
तसर्थ, इन भिट्रो टिस्यु कल्चरलाई बिरुवाको द्रुत प्रसार, जर्मप्लाज्म स्रोतहरूको संरक्षण र औषधीय यौगिकहरूको उत्पादन बढाउनको लागि प्रभावकारी विधि मानिन्छ [7, 8]। बिरुवा वृद्धि नियामकहरू (PGRs) ले मोर्फोजेनेसिसलाई नियमन गर्न महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छन् र क्यालस र सम्पूर्ण जीवहरूको इन भिट्रो खेतीको लागि आवश्यक छन्। यी विकास प्रक्रियाहरूको सफल समापनको लागि तिनीहरूको सांद्रता र संयोजनहरूको अनुकूलन महत्त्वपूर्ण छ [9]। त्यसकारण, सेन्ट जोन्स वर्ट (H. perforatum) [10] को वृद्धि र पुनर्जन्म क्षमता सुधार गर्न नियामकहरूको उपयुक्त संरचना र एकाग्रता बुझ्नु महत्त्वपूर्ण छ।
आइरन अक्साइड न्यानोपार्टिकल्स (Fe₃O₄) न्यानोपार्टिकल्सको एक वर्ग हो जुन टिस्यु कल्चरको लागि विकसित गरिएको छ वा भइरहेको छ। Fe₃O₄ मा महत्त्वपूर्ण चुम्बकीय गुणहरू, राम्रो जैविक अनुकूलता, र बिरुवाको वृद्धिलाई बढावा दिने र वातावरणीय तनाव कम गर्ने क्षमता छ, त्यसैले यसले टिस्यु कल्चर डिजाइनहरूमा उल्लेखनीय ध्यान आकर्षित गरेको छ। यी न्यानोपार्टिकल्सको सम्भावित अनुप्रयोगहरूमा कोशिका विभाजनलाई बढावा दिन, पोषक तत्वहरूको सेवन सुधार गर्न र एन्टिअक्सिडेन्ट इन्जाइमहरू सक्रिय गर्न इन भिट्रो कल्चरलाई अनुकूलन गर्ने समावेश हुन सक्छ [11]।
यद्यपि न्यानोपार्टिकल्सले बिरुवाको वृद्धिमा राम्रो प्रवर्द्धनात्मक प्रभावहरू देखाएको छ, Fe₃O₄ न्यानोपार्टिकल्स र *H. perforatum* मा अनुकूलित बिरुवा वृद्धि नियामकहरूको संयुक्त प्रयोगमा अध्ययनहरू दुर्लभ छन्। यो ज्ञानको खाडल भर्नको लागि, यस अध्ययनले औषधीय बिरुवाहरूको विशेषताहरू सुधार गर्न नयाँ अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्न इन भिट्रो मोर्फोजेनेसिस र माध्यमिक मेटाबोलाइट उत्पादनमा तिनीहरूको संयुक्त प्रभावहरूको प्रभावहरूको मूल्याङ्कन गर्‍यो। त्यसकारण, यस अध्ययनका दुई उद्देश्यहरू छन्: (१) प्रभावकारी रूपमा क्यालस गठन, अंकुर पुनर्जनन, र जरा गाड्न इन भिट्रोलाई प्रवर्द्धन गर्न बिरुवा वृद्धि नियामकहरूको सांद्रतालाई अनुकूलन गर्नुहोस्; र (२) इन भिट्रोमा वृद्धि प्यारामिटरहरूमा Fe₃O₄ न्यानोपार्टिकल्सको प्रभावहरूको मूल्याङ्कन गर्नुहोस्। भविष्यका योजनाहरूमा अनुकूलन (इन भिट्रो) को समयमा पुनर्जन्मित बिरुवाहरूको बाँच्ने दरको मूल्याङ्कन समावेश छ। यो अध्ययनको नतिजाले *H. perforatum* को माइक्रोप्रोपेगेशन दक्षतामा उल्लेखनीय सुधार गर्नेछ, जसले गर्दा यो महत्त्वपूर्ण औषधीय बिरुवाको दिगो प्रयोग र जैवप्रौद्योगिकी अनुप्रयोगहरूमा योगदान पुर्‍याउनेछ भन्ने अपेक्षा गरिएको छ।
यस अध्ययनमा, हामीले खेतमा उब्जाइएका वार्षिक सेन्ट जोन्स वर्ट बिरुवाहरू (मातृ बिरुवाहरू) बाट पातको एक्सप्लान्टहरू प्राप्त गर्यौं। यी एक्सप्लान्टहरू इन भिट्रो कल्चर अवस्थाहरू अनुकूलन गर्न प्रयोग गरिएको थियो। कल्चर गर्नु अघि, पातहरूलाई धेरै मिनेटको लागि बगिरहेको आसुत पानीमा राम्ररी पखालिएको थियो। त्यसपछि एक्सप्लान्ट सतहहरूलाई ७०% इथेनॉलमा ३० सेकेन्डको लागि डुबाएर कीटाणुरहित गरियो, त्यसपछि १.५% सोडियम हाइपोक्लोराइट (NaOCl) घोलमा १० मिनेटको लागि ट्वीन २० को केही थोपाहरू डुबाएर। अन्तमा, अर्को कल्चर माध्यममा स्थानान्तरण गर्नु अघि एक्सप्लान्टहरूलाई बाँझ आसुत पानीले तीन पटक पखालियो।
अर्को चार हप्तामा, अंकुर पुनर्जनन प्यारामिटरहरू मापन गरियो, जसमा पुनर्जनन दर, प्रति एक्सप्लान्ट अंकुर संख्या, र अंकुर लम्बाइ समावेश थियो। पुनरुत्पादित अंकुरहरू कम्तिमा २ सेन्टिमिटरको लम्बाइमा पुगेपछि, तिनीहरूलाई आधा-शक्ति MS माध्यम, ०.५ मिलीग्राम/लिटर इन्डोलेब्युटिरिक एसिड (IBA), र ०.३% ग्वार गम मिलेर जरा बनाउने माध्यममा स्थानान्तरण गरियो। जरा बनाउने कल्चर तीन हप्तासम्म जारी रह्यो, जसको समयमा जरा बनाउने दर, जरा संख्या, र जराको लम्बाइ मापन गरियो। प्रत्येक उपचार तीन पटक दोहोर्याइएको थियो, प्रति प्रतिकृति १० एक्सप्लान्टहरू कल्चर गरिएको थियो, प्रति उपचार लगभग ३० एक्सप्लान्टहरू उत्पादन गरिएको थियो।
बिरुवाको आधारदेखि सबैभन्दा अग्लो पातको टुप्पोसम्म रुलर प्रयोग गरेर बिरुवाको उचाइ सेन्टिमिटर (सेमी) मा मापन गरिएको थियो। बिरुवाहरू सावधानीपूर्वक हटाएर बढ्दो माध्यम हटाएपछि तुरुन्तै जराको लम्बाइ मिलिमिटर (मिमी) मा मापन गरिएको थियो। प्रत्येक बिरुवामा प्रति एक्सप्लान्ट कोपिलाहरूको संख्या सिधै गणना गरिएको थियो। पातहरूमा कालो धब्बाको संख्या, जसलाई नोड्युल भनिन्छ, दृश्यात्मक रूपमा मापन गरिएको थियो। यी कालो नोड्युलहरू हाइपरिसिन, वा अक्सिडेटिभ स्पटहरू भएको ग्रन्थीहरू मानिन्छन्, र उपचारमा बिरुवाको प्रतिक्रियाको शारीरिक सूचकको रूपमा प्रयोग गरिन्छ। सबै बढ्दो माध्यम हटाएपछि, बिरुवाको ताजा तौल मिलिग्राम (मिलीग्राम) को शुद्धताको साथ इलेक्ट्रोनिक स्केल प्रयोग गरेर मापन गरिएको थियो।
कलस गठनको दर गणना गर्ने विधि यस प्रकार छ: विभिन्न वृद्धि नियामकहरू (काइनेज, २,४-डी, र Fe३O४) भएको माध्यममा चार हप्तासम्म एक्सप्लान्टहरूको संवर्धन गरेपछि, कलस बनाउन सक्षम एक्सप्लान्टहरूको संख्या गणना गरिन्छ। कलस गठनको दर गणना गर्ने सूत्र निम्नानुसार छ:
प्रत्येक उपचार तीन पटक दोहोर्याइएको थियो, प्रत्येक पुनरावृत्तिमा कम्तिमा १० वटा एक्सप्लान्टहरूको जाँच गरिएको थियो।
पुनर्जन्म दरले कलस गठन चरण पछि कोपिला भिन्नता प्रक्रिया सफलतापूर्वक पूरा गर्ने कलस तन्तुको अनुपातलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ। यो सूचकले कलस तन्तुको विभेदित तन्तुमा रूपान्तरण हुने र नयाँ बिरुवा अंगहरूमा बढ्ने क्षमतालाई प्रदर्शन गर्दछ।
जरा गाड्न सक्ने हाँगाहरूको संख्या र कुल हाँगाहरूको संख्याको अनुपात भनेको जरा गाड्न सक्ने हाँगाहरूको संख्या हो। यो सूचकले जरा गाड्ने चरणको सफलतालाई प्रतिबिम्बित गर्दछ, जुन सूक्ष्म प्रजनन र बिरुवाको प्रसारमा महत्त्वपूर्ण छ, किनकि राम्रो जराले बिरुवालाई बढ्दो अवस्थामा राम्रोसँग बाँच्न मद्दत गर्दछ।
हाइपरिसिन यौगिकहरू ९०% मेथानोलको साथ निकालिएको थियो। पचास मिलीग्राम सुकेको बिरुवाको सामग्री १ मिलीलीटर मेथानोलमा थपियो र अँध्यारोमा कोठाको तापक्रममा अल्ट्रासोनिक क्लीनर (मोडेल A5120-3YJ) मा २० मिनेटको लागि ३० kHz मा सोनिकेट गरियो। सोनिकेट गरेपछि, नमूनालाई १५ मिनेटको लागि ६००० rpm मा सेन्ट्रीफ्यूज गरियो। सुपरनेटेन्ट सङ्कलन गरियो, र Conceiçao et al द्वारा वर्णन गरिएको विधि अनुसार Plus-3000 S स्पेक्ट्रोफोटोमिटर प्रयोग गरेर हाइपरिसिनको अवशोषण ५९२ nm मा मापन गरियो। [14]।
बिरुवा वृद्धि नियामकहरू (PGRs) र आइरन अक्साइड न्यानोपार्टिकल्स (Fe₃O₄-NPs) सँग गरिएको धेरैजसो उपचारले पुन: उत्पन्न गरिएका कोपिलाका पातहरूमा कालो गाँठो गठनलाई प्रेरित गरेन। ०.५ वा १ मिलीग्राम/लिटर २,४-डी, ०.५ वा १ मिलीग्राम/लिटर किनेटिन, वा १, २, वा ४ मिलीग्राम/लिटर आइरन अक्साइड न्यानोपार्टिकल्स भएको कुनै पनि उपचारमा कुनै गाँठो देखिएन। केही संयोजनहरूले किनेटिन र/वा आइरन अक्साइड न्यानोपार्टिकल्सको उच्च सांद्रतामा नोड्युल विकासमा थोरै वृद्धि देखाए (तर तथ्याङ्कीय रूपमा महत्त्वपूर्ण छैन), जस्तै किनेटिन (१-१.५ मिलीग्राम/लिटर) र आइरन अक्साइड न्यानोपार्टिकल्स (२-४ मिलीग्राम/लिटर) सँग २,४-डी (०.५-२ मिलीग्राम/लिटर) को संयोजन। यी परिणामहरू चित्र २ मा देखाइएका छन्। कालो गाँठोहरू हाइपरसिन-समृद्ध ग्रंथिहरू प्रतिनिधित्व गर्दछ, दुबै प्राकृतिक रूपमा हुने र लाभदायक। यस अध्ययनमा, कालो गाँठोहरू मुख्यतया तन्तुहरूको खैरोपनसँग सम्बन्धित थिए, जसले हाइपरसिन संचयको लागि अनुकूल वातावरणलाई संकेत गर्दछ। २,४-डी, किनेटिन, र Fe₃O₄ न्यानोपार्टिकल्सको उपचारले क्यालसको वृद्धि, खैरोपन कम गर्ने र क्लोरोफिल सामग्री बढाउने कामलाई बढावा दियो, जसले मेटाबोलिक कार्यमा सुधार र अक्सिडेटिभ क्षतिको सम्भावित कमीको सुझाव दिन्छ [३७]। यस अध्ययनले सेन्ट जोन्स वर्ट क्यालसको वृद्धि र विकासमा २,४-डी र Fe₃O₄ न्यानोपार्टिकल्सको संयोजनमा किनेटिनको प्रभावको मूल्याङ्कन गर्‍यो (चित्र ३a–g)। अघिल्ला अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि Fe₃O₄ न्यानोपार्टिकल्समा एन्टिफंगल र एन्टिमाइक्रोबियल गतिविधिहरू हुन्छन् [३८, ३९] र, बिरुवाको वृद्धि नियामकहरूसँग संयोजनमा प्रयोग गर्दा, बिरुवाको प्रतिरक्षा संयन्त्रलाई उत्तेजित गर्न र सेलुलर तनाव सूचकांकहरू कम गर्न सक्छ [१८]। यद्यपि माध्यमिक मेटाबोलाइट्सको जैवसंश्लेषण आनुवंशिक रूपमा नियमन गरिएको छ, तिनीहरूको वास्तविक उपज वातावरणीय अवस्थाहरूमा अत्यधिक निर्भर छ। मेटाबोलिक र रूपात्मक परिवर्तनहरूले विशिष्ट बिरुवा जीनको अभिव्यक्तिलाई नियमन गरेर र वातावरणीय कारकहरूलाई प्रतिक्रिया दिएर माध्यमिक मेटाबोलाइट स्तरहरूलाई प्रभाव पार्न सक्छ। यसबाहेक, इन्ड्युसरहरूले नयाँ जीनहरूको सक्रियतालाई ट्रिगर गर्न सक्छन्, जसले फलस्वरूप इन्जाइमेटिक गतिविधिलाई उत्तेजित गर्छ, अन्ततः धेरै बायोसिन्थेटिक मार्गहरू सक्रिय गर्छ र माध्यमिक मेटाबोलाइटहरूको गठन निम्त्याउँछ। यसबाहेक, अर्को अध्ययनले देखाएको छ कि छायाँ घटाउँदा सूर्यको प्रकाशको जोखिम बढ्छ, जसले गर्दा *हाइपरिकम पर्फोरेटम* को प्राकृतिक बासस्थानमा दिनको तापक्रम बढ्छ, जसले हाइपरिकिन उपज बढाउन पनि योगदान पुर्‍याउँछ। यी तथ्याङ्कहरूको आधारमा, यस अध्ययनले टिस्यु कल्चरमा सम्भावित इन्ड्युसरको रूपमा फलामको न्यानोपार्टिकल्सको भूमिकाको अनुसन्धान गर्‍यो। नतिजाहरूले देखाए कि यी न्यानोपार्टिकल्सहरूले इन्जाइमेटिक उत्तेजना मार्फत हेस्पेरिडिन बायोसिन्थेसिसमा संलग्न जीनहरूलाई सक्रिय गर्न सक्छन्, जसले गर्दा यो यौगिकको संचय बढ्छ (चित्र २)। त्यसकारण, प्राकृतिक अवस्थामा बढ्दै गएका बिरुवाहरूको तुलनामा, यो तर्क गर्न सकिन्छ कि मध्यम तनाव माध्यमिक मेटाबोलाइटहरूको बायोसिन्थेसिसमा संलग्न जीनहरूको सक्रियतासँग जोड्दा भिभोमा यस्ता यौगिकहरूको उत्पादन पनि बढाउन सकिन्छ। संयोजन उपचारहरूले सामान्यतया पुनर्जनन दरमा सकारात्मक प्रभाव पार्छ, तर केही अवस्थामा, यो प्रभाव कमजोर हुन्छ। उल्लेखनीय रूपमा, १ मिलीग्राम/लिटर २,४-डी, १.५ मिलीग्राम/लिटर किनेज, र विभिन्न सांद्रताहरूसँग उपचारले नियन्त्रण समूहको तुलनामा स्वतन्त्र रूपमा र उल्लेखनीय रूपमा पुनर्जनन दर ५०.८५% ले बढाउन सक्छ (चित्र ४c)। यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छ कि न्यानोहर्मोनहरूको विशिष्ट संयोजनले बिरुवाको वृद्धि र मेटाबोलाइट उत्पादनलाई बढावा दिन समन्वयात्मक रूपमा कार्य गर्न सक्छ, जुन औषधीय बिरुवाहरूको टिस्यु कल्चरको लागि ठूलो महत्त्वको छ। पामर र केलर [५०] ले देखाए कि २,४-डि उपचारले सेन्ट पर्फोरेटममा स्वतन्त्र रूपमा कलस गठनलाई प्रेरित गर्न सक्छ, जबकि काइनेजको थपले कलस गठन र पुनर्जननलाई उल्लेखनीय रूपमा बढायो। यो प्रभाव हार्मोनल सन्तुलनमा सुधार र कोशिका विभाजनको उत्तेजनाको कारणले भएको थियो। बाल एट अल। [५१] ले फेला पारे कि Fe₃O₄-NP उपचारले स्वतन्त्र रूपमा एन्टिअक्सिडेन्ट इन्जाइमहरूको कार्य बढाउन सक्छ, जसले गर्दा सेन्ट पर्फोरेटममा जराको वृद्धिलाई बढावा दिन्छ। ०.५ मिलीग्राम/लिटर, १ मिलीग्राम/लिटर, र १.५ मिलीग्राम/लिटरको सांद्रतामा Fe₃O₄ न्यानोपार्टिकल्स भएको कल्चर मिडियाले सन बिरुवाहरूको पुनर्जनन दरमा सुधार ल्यायो [५२]। काइनटिन, २,४-डाइक्लोरोबेन्जोथियाजोलिनोन, र Fe₃O₄ न्यानोपार्टिकल्सको प्रयोगले क्यालस र जरा गठन दरमा उल्लेखनीय सुधार ल्यायो, यद्यपि, इन भिट्रो पुनर्जननको लागि यी हार्मोनहरू प्रयोग गर्दा हुने सम्भावित साइड इफेक्टहरूलाई विचार गर्न आवश्यक छ। उदाहरणका लागि, २,४-डाइक्लोरोबेन्जोथियाजोलिनोन वा काइनटिनको दीर्घकालीन वा उच्च-सांद्रता प्रयोगले सोमाटिक क्लोनल भिन्नता, अक्सिडेटिभ तनाव, असामान्य क्यालस आकारविज्ञान, वा भिट्रिफिकेशन निम्त्याउन सक्छ। त्यसकारण, उच्च पुनर्जनन दरले आनुवंशिक स्थिरताको भविष्यवाणी गर्दैन। सबै पुनर्जनित बिरुवाहरूको मूल्याङ्कन आणविक मार्करहरू (जस्तै RAPD, ISSR, AFLP) वा साइटोजेनेटिक विश्लेषण प्रयोग गरेर तिनीहरूको एकरूपता र इन भिभो बिरुवाहरूसँग समानता निर्धारण गर्न गर्नुपर्छ [53,54,55]।
यस अध्ययनले पहिलो पटक देखाएको छ कि Fe₃O₄ न्यानोपार्टिकल्ससँग बिरुवा वृद्धि नियामकहरू (२,४-डी र किनेटिन) को संयुक्त प्रयोगले *हाइपरिकम पर्फोरेटम* मा मोर्फोजेनेसिस र प्रमुख जैविक सक्रिय मेटाबोलाइटहरू (हाइपरिसिन र हाइपरोसाइड सहित) को संचय बढाउन सक्छ। अनुकूलित उपचार पद्धति (१ मिलीग्राम/लिटर २,४-डी + १ मिलीग्राम/लिटर किनेटिन + ४ मिलीग्राम/लिटर Fe₃O₄-NPs) ले कलस गठन, अर्गानोजेनेसिस, र माध्यमिक मेटाबोलाइट उपजलाई अधिकतम मात्र बनाएन तर हल्का उत्प्रेरक प्रभाव पनि प्रदर्शन गर्‍यो, सम्भावित रूपमा बिरुवाको तनाव सहनशीलता र औषधीय मूल्यमा सुधार गर्दै। न्यानोटेक्नोलोजी र बिरुवाको टिस्यु कल्चरको संयोजनले औषधीय यौगिकहरूको ठूलो मात्रामा इन भिट्रो उत्पादनको लागि दिगो र कुशल प्लेटफर्म प्रदान गर्दछ। यी नतिजाहरूले आणविक संयन्त्र, खुराक अनुकूलन र आनुवंशिक परिशुद्धतामा औद्योगिक अनुप्रयोगहरू र भविष्यको अनुसन्धानको लागि मार्ग प्रशस्त गर्दछ, जसले गर्दा औषधीय बिरुवाहरूमा आधारभूत अनुसन्धानलाई व्यावहारिक जैव प्रविधिसँग जोड्दछ।