एन्थेलमिन्टिक औषधि N,N-डाइथाइल-एम-टोलुआमाइड (DEET सम्बन्धी जानकारी) ले AChE (एसिटाइलकोलिनेस्टेरेज) लाई रोक्छ भनेर रिपोर्ट गरिएको छ र अत्यधिक भास्कुलराइजेसनको कारणले सम्भावित कार्सिनोजेनिक गुणहरू छन्। यस पेपरमा, हामी देखाउँछौं कि DEET ले विशेष रूपमा एन्जोजेनेसिसलाई बढावा दिने एन्डोथेलियल कोशिकाहरूलाई उत्तेजित गर्दछ, जसले गर्दा ट्यूमरको वृद्धि बढ्छ। DEET ले एन्जोजेनेसिस निम्त्याउने सेलुलर प्रक्रियाहरूलाई सक्रिय गर्दछ, जसमा प्रसार, माइग्रेसन, र आसंजन समावेश छ। यो एन्डोथेलियल कोशिकाहरूमा NO उत्पादन र VEGF अभिव्यक्ति बढेको छ। M3 को मौनता वा औषधीय M3 अवरोधकहरू प्रयोग गरेर यी सबै प्रभावहरूलाई समाप्त पारिएको छ, जसले सुझाव दिन्छ कि DEET-प्रेरित एन्जोजेनेसिस M3-संवेदनशील छ। एन्डोथेलियल र HEK कोशिकाहरूमा क्याल्सियम सिग्नलिंग समावेश गर्ने प्रयोगहरूले M3 रिसेप्टरहरूको ओभरएक्सप्रेस गर्ने, साथै बाइन्डिङ र डकिङ अध्ययनहरूले संकेत गर्दछ कि DEET ले M3 रिसेप्टरहरूको एलोस्टेरिक मोड्युलेटरको रूपमा काम गर्दछ। यसबाहेक, DEET ले AChE लाई रोक्छ, जसले गर्दा एसिटाइलकोलिनको जैवउपलब्धता र M3 रिसेप्टरहरूमा यसको बाइन्डिङ बढ्छ, र एलोस्टेरिक नियमन मार्फत प्रोएन्जियोजेनिक प्रभावहरू बढाउँछ।
प्राथमिक EC हरूलाई स्विस मुसाको महाधमनीबाट अलग गरिएको थियो। निकासी विधि कोबायाशी प्रोटोकल २६ बाट अनुकूलित गरिएको थियो। मुरिन EC हरूलाई चौथो मार्गसम्म ५% ताप-निष्क्रिय FBS सँग पूरक EBM-2 माध्यममा कल्चर गरिएको थियो।
HUVEC, U87MG, वा BF16F10 को प्रसारमा DEET को दुई सांद्रताको प्रभावलाई CyQUANT सेल प्रोलिफरेशन एसे किट (मोलेकुलर प्रोब्स, C7026) प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो। संक्षेपमा, प्रति इनार ५.१०३ कोषहरूलाई ९६-इनार प्लेटमा बीउ गरिएको थियो, रातभर जोड्न अनुमति दिइएको थियो, र त्यसपछि २४ घण्टाको लागि DEET ले उपचार गरिएको थियो। वृद्धि माध्यम हटाएपछि, माइक्रोप्लेटको प्रत्येक इनारमा डाई बाइन्डिङ घोल थप्नुहोस् र कोषहरूलाई ३७ डिग्री सेल्सियसमा ३० मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्। ४८५ एनएम उत्तेजना फिल्टर र ५३० एनएम उत्सर्जन फिल्टरहरूले सुसज्जित मिथ्रास LB940 मल्टिमोड माइक्रोप्लेट रिडर (बर्थोल्ड टेक्नोलोजीज, ब्याड वाइल्डब्याड, जर्मनी) प्रयोग गरेर फ्लोरोसेन्स स्तरहरू निर्धारण गरिएको थियो।
HUVEC लाई ९६-कुवा प्लेटहरूमा प्रति कुवा १०४ कोषहरूको घनत्वमा सिड गरिएको थियो। कोषहरूलाई २४ घण्टाको लागि DEET ले उपचार गरिएको थियो। कोष व्यवहार्यतालाई कलरिमेट्रिक MTT परख (सिग्मा-एल्ड्रिच, M5655) प्रयोग गरेर मूल्याङ्कन गरिएको थियो। अप्टिकल घनत्व मानहरू ५७० nm को तरंगदैर्ध्यमा मल्टिमोड माइक्रोप्लेट रिडर (मिथ्रास LB940) मा प्राप्त गरिएको थियो।
इन भिट्रो एन्जियोजेनेसिस एसेज प्रयोग गरेर DEET को प्रभावहरूको अध्ययन गरिएको थियो। १०-८ M वा १०-५ M DEET को साथ उपचारले HUVECs मा केशिका लम्बाइको गठन बढायो (चित्र १a, b, सेतो बारहरू)। नियन्त्रण समूहको तुलनामा, १०-१४ देखि १०-५ M सम्मको DEET सांद्रता भएको उपचारले केशिका लम्बाइ १०-८ M DEET मा पठारमा पुगेको देखाएको छ (पूरक चित्र S2)। १०-८ M र १०-५ M को सांद्रता दायरामा DEET सँग उपचार गरिएका HUVECs को इन भिट्रो प्रोएन्जियोजेनिक प्रभावमा कुनै महत्त्वपूर्ण भिन्नता फेला परेन।
नियोभास्कुलराइजेसनमा DEET को प्रभाव निर्धारण गर्न, हामीले इन भिभो नियोभास्कुलराइजेसन अध्ययनहरू गर्यौं। १४ दिन पछि, १०-८ M वा १०-५ M DEET को साथ प्रिकल्चर गरिएको एन्डोथेलियल कोशिकाहरू इन्जेक्सन गरिएका मुसाहरूले हेमोग्लोबिन सामग्रीमा उल्लेखनीय वृद्धि देखाए (चित्र १c, सेतो बारहरू)।
यसबाहेक, DEET-प्रेरित नियोभास्कुलराइजेसन U87MG जेनोग्राफ्ट-वाहक मुसाहरूमा अध्ययन गरिएको थियो जसलाई दैनिक (ip) DEET ले १०-५ M को प्लाज्मा सांद्रता प्रेरित गर्ने खुराकमा इंजेक्शन गरिएको थियो, जुन खुला मानिसमा सामान्य हो। २३ मा। U87MG कोषहरू मुसामा इंजेक्शन गरेको १४ दिन पछि पत्ता लगाउन सकिने ट्युमरहरू (अर्थात् ट्युमर >१०० mm3) अवलोकन गरिएको थियो। २८ औं दिनमा, नियन्त्रण मुसाहरूको तुलनामा DEET-उपचार गरिएका मुसाहरूमा ट्युमरको वृद्धि उल्लेखनीय रूपमा बढेको थियो (चित्र १d, वर्ग)। यसबाहेक, ट्युमरहरूको CD31 दागले DEET ले केशिका क्षेत्र उल्लेखनीय रूपमा बढाएको देखाएको छ तर माइक्रोभेसेल घनत्व होइन। (चित्र १e–g)।
DETA-प्रेरित प्रसारमा मस्करीनिक रिसेप्टरहरूको भूमिका निर्धारण गर्न, pFHHSiD (१०-७ M, एक चयनात्मक M3 रिसेप्टर विरोधी) को उपस्थितिमा १०-८ M वा १०-५ M DETA प्रयोग गरिएको थियो। HUVEC को उपचार। pFHHSiD ले सबै सांद्रतामा DETA को प्रजनन गुणहरूलाई पूर्ण रूपमा अवरुद्ध गर्यो (तालिका १)।
यी अवस्थाहरूमा, हामीले DEET ले HUVEC कोषहरूमा केशिका लम्बाइ बढाउने कि नबढाउने भनेर पनि जाँच गर्यौं। त्यस्तै गरी, pFHHSiD ले DEET-प्रेरित केशिका लम्बाइलाई उल्लेखनीय रूपमा रोक्यो (चित्र 1a, b, खैरो बारहरू)। यसबाहेक, M3 siRNA सँग समान प्रयोगहरू गरिएको थियो। यद्यपि नियन्त्रण siRNA केशिका गठनलाई बढावा दिन प्रभावकारी थिएन, M3 मस्करिनिक रिसेप्टरको मौनताले DEET को केशिका लम्बाइ बढाउने क्षमतालाई समाप्त गर्यो (चित्र 1a, b, कालो बारहरू)।
यसबाहेक, १०-८ M वा १०-५ M DEET-प्रेरित भास्कुलराइजेसन इन भिट्रो र नियोभास्कुलराइजेसन इन भिभो दुवै pFHHSiD द्वारा पूर्ण रूपमा अवरुद्ध भएका थिए (चित्र १c, d, सर्कलहरू)। यी नतिजाहरूले संकेत गर्दछ कि DEET ले चयनात्मक M3 रिसेप्टर विरोधीहरू वा M3 siRNA प्रति संवेदनशील मार्ग मार्फत एन्जियोजेनेसिसलाई बढावा दिन्छ।
AChE DEET को आणविक लक्ष्य हो। AChE अवरोधकको रूपमा काम गर्ने डोनेपेजिल जस्ता औषधिहरूले इन भिट्रो र माउस हिन्डलिम्ब इस्केमिया मोडेलहरूमा EC एन्जियोजेनेसिसलाई उत्तेजित गर्न सक्छन्। हामीले HUVEC मा AChE इन्जाइम गतिविधिमा DEET को दुई सांद्रताको प्रभाव परीक्षण गर्यौं। नियन्त्रण अवस्थाहरूको तुलनामा DEET को कम (१०-८ M) र उच्च (१०-५ M) सांद्रताले एन्डोथेलियल AChE गतिविधि घटायो (चित्र २)।
DEET को दुवै सांद्रता (१०-८ M र १०-५ M) ले HUVEC मा एसिटाइलकोलिनेस्टेरेज गतिविधि घटायो। BW284c51 (१०-५ M) एसिटाइलकोलिनेस्टेरेज अवरोधकहरूको लागि नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। परिणामहरू सवारी साधन-उपचार गरिएका कोशिकाहरूको तुलनामा DEET को दुई सांद्रताहरूसँग उपचार गरिएको HUVEC मा AChE गतिविधिको प्रतिशतको रूपमा व्यक्त गरिन्छ। मानहरू छ स्वतन्त्र प्रयोगहरूको औसत ± SEM को रूपमा व्यक्त गरिन्छ। *p < नियन्त्रणको तुलनामा ०.०५ (क्रस्कल-वालिस र डन बहु तुलना परीक्षण)।
नाइट्रिक अक्साइड (NO) एन्जियोजेनिक प्रक्रिया 33 मा संलग्न छ, त्यसैले, DEET-उत्तेजित HUVECs मा NO उत्पादनको अध्ययन गरिएको थियो। DEET-उपचार गरिएको एन्डोथेलियल NO उत्पादन नियन्त्रण कोशिकाहरूको तुलनामा बढाइएको थियो, तर 10-8 M को खुराकमा मात्र महत्त्वमा पुगेको थियो (चित्र 3c)। DEET-प्रेरित NO उत्पादनलाई नियन्त्रण गर्ने आणविक परिवर्तनहरू निर्धारण गर्न, पश्चिमी ब्लटिंग द्वारा eNOS अभिव्यक्ति र सक्रियताको विश्लेषण गरिएको थियो। यद्यपि DEET उपचारले eNOS अभिव्यक्ति परिवर्तन गरेन, यसले eNOS फास्फोरिलेसन (चित्र 3d) मा उपचार नगरिएका कोशिकाहरूको तुलनामा यसको सक्रिय साइट (Ser-1177) मा eNOS फास्फोरिलेसनलाई उल्लेखनीय रूपमा बढायो (चित्र 3d)। यसबाहेक, सक्रियता साइट र निषेध साइटमा फस्फोरिलेसन गरिएको eNOS को अनुपात इन्जाइमको कुल मात्रामा फस्फोरिलेसन गरिएको eNOS को मात्रा सामान्यीकरण गरेपछि गणना गरिएको थियो। उपचार नगरिएका कोशिकाहरूको तुलनामा DEET को प्रत्येक सांद्रतासँग उपचार गरिएको HUVECs मा यो अनुपात उल्लेखनीय रूपमा बढाइएको थियो (चित्र 3d)।
अन्तमा, मुख्य प्रोएन्जियोजेनिक कारकहरू मध्ये एक, VEGF को अभिव्यक्ति, पश्चिमी ब्लटिंग द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो। DEET ले VEGF अभिव्यक्तिलाई उल्लेखनीय रूपमा बढायो, जबकि pFHHSiD ले यो अभिव्यक्तिलाई पूर्ण रूपमा अवरुद्ध गर्यो।
DEET को प्रभावहरू M3 रिसेप्टरहरूको औषधीय नाकाबन्दी र डाउनरेगुलेसन दुवैप्रति संवेदनशील भएकोले, हामीले DEET ले क्याल्सियम सिग्नलिङ बढाउन सक्छ भन्ने परिकल्पनाको परीक्षण गर्यौं। आश्चर्यजनक रूपमा, DEET ले HUVEC (डेटा देखाइएको छैन) र HEK/M3 (चित्र 4a, b) मा प्रयोग गरिएको दुवै सांद्रताको लागि साइटोप्लाज्मिक क्याल्सियम बढाउन असफल भयो।
पोस्ट समय: डिसेम्बर-३०-२०२४